Identificación Bioquímica de Salmonella spp.

Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium

La identificación de Salmonella spp., es de gran importancia en la industria alimentaria (desde la planta de producción hasta la planta de procesamiento), para reducir la probabilidad de contaminación en alimentos, especialmente cuya fuente sea avícola.

Para la identificación de una bacteria es requerida la aplicación de pruebas bioquímicas, especialmente las pruebas que involucran el metabolismo bacteriano, dónde las enzimas características de cada cepa revelen la identidad de la bacteria a describir.

La identificación bioquímica de una bacteria se conoce como batería bioquímica, dónde se emplea una serie de tubos con medios especiales en los que se va evaluar el metabolismo de la bacterias y las enzimas presentes y ausentes.

El primer paso comienza al lograr aislar las colonias sospechosas de ser de Salmonella spp., éstas deben ser transferidas con un asa bacteriológica en punta estéril a una serie de pruebas bacteriológicas, con los medios de TSI (Triple sugar iron) y LIA (Lysine-iron agar)

El medio TSI, contiene: peptona, agar, lactosa, sucrosa, cloruro de sodio, extracto de carne, extracto de levadura, glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol. Su uso principal es para la diferenciación de miembros de Enterobacteriaceae basado en la fermentación de la lactosa, sucrosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico.

Para la preparación de LIA, se requiere de: agar, L-lisina, digesto pancreático de gelatina, extracto de levadura, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y púrpura de bromocresol, a un pH final entre 6.7 ± 0.2. Su aplicación es para el cultivo y diferenciación de los miembros de Enterobacteriaceae basado en su habilidad de descarboxilar lisina y formas ácido sulfhídrico. Las bacterias que descarboxilan lisina tornan el medio en púrpura y las bacterias que producen ácido sulfhídrico se muestran como colonias negras.

En cada prueba se debe deslizar el asa bacteriológica de forma estríada en la superficie del agar y luego introducir la punta del asa en los medios evaluados. Es importante señalar que el pase de las colonias debe realizarse a partir de una colonia bien aislada, dado que LIA y TSI, son empleadas para seleccionar bioquímicamente colonias sospechosas de Salmonella spp. Si se introduce un cultivo mixto en éstos medios, los resultados pueden ser inespecíficos.

Si las colonias sospechosas son encontradas solo es áreas cargadas de colonias mixtas  en el agar,  es prudente re-sembrar las colonias sospechosas, con el fin de obtener un cultivo puro previo a la inoculación de éstas colonias en TSI y LIA. Estos medio diferenciales deben ser evaluados después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Salmonella en TSI and LIA

Salmonella en TSI and LIA

Es particularmente importante con TSI, ya que una inclinación ácida a las 24 horas a menudo vuelve a ser alcalina con una incubación más prolongada, debido a los componentes proteicos del medio que usan después del agotamiento de los carbohidratos. Las observaciones con respecto al gas y al ácido sulfhídrico son útiles y se debe concentrar la atención en las reacciones al extremo y en la inclinación de los cultivos, independientemente si se manifiesta el ácido sulfhídrico o la producción de gas.

También debemos tener que en cuenta que las muestras de laboratorio que se envían pueden contener varios patógenos entéricos, no solo Salmonella y se pueden agregar agares selectivos/diferenciales para colectar más información para su identificación. Otros medios que se pueden utilizar además de LIA y TSI son:

  • Medio de Indol y Ornitina de motilidad (MIO)
  • Agar de Urea de Christensen
  • Citrato de Simmon
  • Motilidad de ornitina

En un aislado de Salmonella, se espera que en sus pruebas bioquímicas, esta descarboxile la lisina en LIA, fermente la glucosa anaeróbicamente en agar TSI, produzcan ácido sulfhídrico en agar TSI y en LIA. En las pruebas complementarias se espera que utilice el citrato, que tenga incapacidad para hidrolizar urea, producir indol a partir de triptófano.

Las reacciones de azúcar, comprenden la fermentación de glucosa manitol, maltosa y dulcitol y la incapacidad de fermentar lactosa, sacarosa y salicina. Estas reacciones bioquímicas se pueden llevar a cabo convenientemente en los medios compuestos para la identificación bacteriana, como el agar Kohn o  TSI.

Los cultivos que dan las reacciones bioquímicas características de las especies de Salmonella se prueban con los sueros O y H apropiados hasta que se identifican el grupo y el serotipo. Las pruebas bioquímicas para la identificación de salmonellas se pueden combinar para formar una prueba de identificación. Algunos de estos, como los sistemas API 20E o Enterotube II, están actualmente disponibles para su compra.

 

Fuente:

  1. Yousef, Ahmed Elmeleigy. (2003). Food microbiology : a laboratory manual. Hoboken, N.J. :John Wiley & Sons.
  2. Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. In Poultry Diseases (Sixth Edition) (pp. 110-145).
  3. García, M., & Silva, M. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Identificación bioquímica y tipado microbiológico. Unidad didáctica55, 346.
  4. Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2013). Handbook of media for clinical and public health microbiology. CRC Press.
  5. Atlas, R. M. (2006). The handbook of microbiological media for the examination of food. CRC Press.
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Los Postulados de Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch fue uno de los más importantes bacteriólogos de todos los tiempos, trabajó como médico rural, donde comenzó su carrera científica como bacteriólogo. Su primera contribución a la microbiología fue el aislamiento de Bacillus anthracis, agente etiológico del carbunco bacteriano, a raíz de sus investigaciones sobre el Carbunco Koch enunció una serie de leyes, los Postulados de Koch, que constituyen su mayor contribución a la historia de la Microbiología.

Estos postulados se han tomado describe la etiología de todos los agentes causantes de una enfermedad infecciosa, aunque fueron utilizados originalmente para describir al Carbunco bacteriano, una enfermedad que se transmitía de forma frecuente al hombre desde el ganado lanar y vacuno. En sus investigaciones, Koch descubrió que el patógeno se encontraba siempre en la sangre de los animales enfermos, por lo que tomó pequeñas muestras de sangre de estos animales y se las inoculó a animales sanos. El resultado fue la transmisión de la enfermedad.

En una segunda fase de investigación, Koch descubrió que el patógeno podía ser aislado de los individuos enfermos, cultivándolo en el laboratorio sin perder su capacidad patogénica, ya que cuando se les inoculaba a nuevos individuos se reproducía la enfermedad. A partir de estas investigaciones propuso los siguientes postulados:

  • El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad y ausente en los sanos.
  • El agente no debe aparecer en otras enfermedades.
  • El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad
  • El agente ha de provocar la enfermedad en un animal susceptible de ser inoculado.
  • El agente ha de ser aislado de nuevo en las lesiones de los animales en experimentación.

Estos postulados describían la etiología de la tuberculosis, del cual consiguió aislar el Mycobacterium tuberculosis. Un año después aisló el Vibrio cholerae, agente etiológico de la Cólera.

Postulados de Koch

Postulados de Koch 

De este modo se establecía un protocolo para discernir entre las muchas bacterias o agente biológicos presentes en cualquier tejido de cualquier animal. Mientras que muchas bacterias aparecen como parásitos de lesiones provocadas por otros agentes, solo hay un agente que provoque realmente la lesión. La importancia de los postulados de Koch consiste en la utilización de los cultivos puros, cosa que es necesaria para discernir el verdadero causante de la enfermedad.

Aunque la mayoría de las bacterias infecciosas causantes de la enfermedad en humanos cumplen los postulados, hay algunas excepciones. Mycobacterium leprae, no se ha podido cultivar in vitro como cultivo puro, por lo que incumple el tercer postulado. Solo se ha podido cultivar in vivo en las almohadillas de las patas de un armadillo.

Actualmente los postulados de Koch constituyen la piedra angular de cualquier estudio sobre la etiología de una enfermedad y son una herramienta de vital importancia para la rápida identificación de nuevos patógenos (enfermedades emergentes y reemergentes) con el fin de aplicar tratamientos preventivos. Pese a las muchas teorías formuladas en su contra, apenas han sufrido modificación alguna conservando toda su vigencia y validez.

Fuente:

Fuentes Castillo C. (2007) Los postulados de Koch: Revisión histórica y perspectiva actual, Revista Complutense de Ciencias Veterinarias Vol. 1 (2) p.262-266.

Pineda Vásquez ME., Microbiología: Aspectos Históricos, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira.

Aislamiento de Bacterias Anaerobias

Bacterias Anaerobias

Bacterias Anaerobias

La presencia o ausencia de oxígeno, influencia fuertemente el metabolismo de los microorganismos, permitiendo clasificarlos en tres categorías  de acuerdo a la dependencia de la respiración aeróbica para su desarrollo:

  • Aeróbicos estrictos: Dependen exclusivamente de la respiración aeróbica, dónde el oxígeno es el aceptor final de electrones.
  • Anaeróbicos estrictos: el oxígeno es tóxico.
  • Anaeróbicos facultativos: Son bacterias que poseen un sistema de enzimas que les permiten utilizar oxígeno libre o alguna fuente alternativa de oxígeno como es el nitrato. Si el oxígeno esta presente, tienden a utilizarlo en preferencia a la vía alternativa. Hay microorganismos que se les considera indiferentes, porque no muestran preferencia por ninguna condición aerobia o anaerobia, pueden crecer bien en condiciones aerobias y anaerobias.
  • Microaerofilos: Son organismos que requieren oxígeno libre, pero solo en pequeñas cantidades.

Cuatro de las consideraciones más importantes en el cultivo de bacterias anaerobias son:

  1. Cultivar el material clínico inmediatamente después de obtenido.
  2. Emplear medios frescos
  3. Obtener adecuadas condiciones anaerobias.
  4. Efectuar el subcultivo de colonias inmediatamente después de sacarlas de un medio anaerobio.

Las muestras clínicas se deben cultivar inmediatamente después de colectadas pues algunos organismos anaerobios  son bastantes sensibles al ser expuestas al oxígeno y mueren rápidamente en un medio aerobio.

Se prefieren los líquidos aspirados, al material obtenido con escobillón (no permitir nunca que los materiales de los escobillones se seque).  Si no es posible cultivar una muestra de inmediato, el material debe colocarse en un medio que contenga un agente reductor como cisteína o tioglicolato a la temperatura ambiente durante un periodo que no exceda de dos horas.

Preparar y teñir frotis directos de cada muestra. Para tener idea de la cantidad y el tipo de organismo en la muestra. También puede ser útil examinar montajes húmedos de material no teñido, frotis con tinción para ácido-resistentes, y frotis teñidos con Giemsa. Empléense pipetas capilares para preparar frotis de muestras líquidas o utilícense los escobillones directamente. Importante registrar:

Tubo de ensayo .jpg

  1. La reacción al gram, el tamaño, la forma y la cantidad relativa de los organismos presentes.
  2. La presencia de esporas y su forma y posición en la célula.
  3. Cualquier características morfológica especial como ramificación, pseudo-ramificación, formación de cadenas, filamentos, cuerpos esféricos, o diminutas formas granulares.

Inocular medios primarios de aislamiento lo más pronto posible una vez recibidas las muestras:

  • Muestras líquidas: Utilizar una pipeta capilar para inocular los medios líquidos o semisólidos cerca gotas de inóculo . del fondo con 1 ó 2 gotas del inóculo. Colocar 1 gota en cada medio de cultivo en placa y sembrar por estría para lograr aislamiento.
    • Para el aislamiento de Bacteroides melaninogenicus, se debe añadir 5.0 mg de hemina y 0.5mg de menadiona (esterilizada con filtro) a cada litro de medio de cultivo para aislamiento.
  • Tejidos u otras muestras sólidas: Añadir suficiente caldo de tioglicolato para emulsionar la muestra, añadir arena estéril en cantidad necesaria y moler en un mortero. Proceder vcomo en el muestra líquida.
  • Escobillones: Colocar el escobillón directamente dentro de los medios líquidos y utilizar otro escobillón para sembrar las placas. Si es necesario, se puede preparar una suspensión inoculante enjuaguagando suavemente el inóculo de un escobillón en aproximadamente 2 ml de medio de tioglicolato.
    • Calentar todo el medio líquido y semisólido en un baño de agua hirviente durante 10 minutos y enfriarlo antes de la inoculación

Fuente:

V. R. Dowell Jr., T. M. Hawkins (1975) Métodos de Laboratorio en Bacteriología Anaeróbica, Departamento de Salud Educación y Bienestar de E.U.A., Administración de Servicios de Salubridad y Salud Mental, Centro Regional de Ayuda Técnica, México/Buenos Aires.

H. J. Benson (2002) Cultivation of Anaerobes in: Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology, 8th Edition, McGraw-Hill Higher Education, p.89.

Epidemia – Infección Meningocócica

Microscopía electrónica de bacterias del género Neisseria

He encontrado dentro de mis revisiones del programa “Cazadores de Virus” otro patógeno, potencial, causante de fuertes brotes epidémicos. Este microorganismo provoca en su victima una infección meningocócica, de este nombre puedo intuir que 1) es un coco 2) que causa meningitis 3) que se le dice coloquialmente meningococo; pero no me dice contra que patógeno nos encontramos.

Bueno este patógeno no es más ni menos que la bacteria Neisseria meningitidis, de la familia Neisseriaceae. El cual fue aislado por primera vez del líquido cefalorraquídeo de enfermos de meningitis. Fue estudiado detalladamente por A. Weichselbaum en 1887.

Los serogrupos de Neisseria meningitidis se clasficican en:

  • Serogrupo A, epidemias en África subsahariana y otros países en desarrollo.
  • Serogrupo B, casos esporádicos en países industrializados.
  • Serogrupo C, brotes epidémicos en países industrializados.
  • Serogrupo Y y W-135 más frecuentes en pacientes con neumonía.

Esta bacteria es un coco dispuesto en pareja (diplococo), que tiene de 0.6 a 1,0 micra de diámetro. Es gramnegativo, no forma esporas ni cápsulas, careciendo de flagelos. En los cultivos puros se dispone en tétrada (grupo de cuatro); en el pus se encuentra, frecuentemente, en el interior de los leucocitos.

En los frotis, realizados a partir de los cultivos, se encuentran cocos pequeños o muy grandes, dispuestos, asiladamente, por pareja o en grupos de cuatro. Esta bacteria puede modificar no sólo su forma, sino también su tinción por el método de Gram, de manera que en las preparaciones, entre diplococos gramnegativos, encontramos también, células grampositivas.

El meningococo es aerobio, no crece en los medios corrientes, puede cultivarse en medios que se la haya agregado suero o líquido ascítico a un pH de 7.2-7.4; la temperatura óptima para su crecimiento es de 36-37°C, a 22°C no se desarrolla. En los medios sólidos forma colonias transparentes, delicadas, de 2-3 mm  de diámetro; en el caldo con suero produce enturbiamiento y precipitado en el fondo, apareciendo en la superficie una película al cabo de 3-4 días.

Los meningococos pueden adaptarse a los medios sencillos, mediante el paso paulatino de las concentraciones óptimas de proteínas en el medio nutritivo a las mínimas.

Este patógeno produce substancias tóxicas, con propiedades de exo y endotoxinas; al desintegrarse los cuerpos bacterianos se libera una endotoxina muy activa. Los meningococos se autolizan fácilmente, acompañándose la autólisis de acumulación de toxina en el medio. La toxina meningocócica puede obtenerse tratando los cuerpos bacterianos con agua destilada, solución de carbonato sódico o provocando la autólisis por calentamiento y los rayos ultravioletas.

Se han encontrado tres fracciones: una hidrocarbonada (C), que es común para todos los meningococos; otra proteína (P), que se ha encontrado también en los gonococos y en los neumococos del tipo III, y una tercera, a la que está asociada la especificidad de los meningococos. Entre los meningococos se distinguen 4 grupos: A, B, C y D. En estos últimos tiempos el número de tipos ha aumentado hasta siete, dominando, sobre todo, por su frecuencia, los dos primeros. Los meningococos se caracterizan por su variabilidad dentro de la especie. En algunos periodos tiene lugar el cambio de tipos.

El meningococo tiene poca resistencia, muriendo en algunas horas por la desecación; muere al cabo de 10 minutos, si se calienta a 60°C; en dos minutos, cuando se le somete a la temperatura de 80°C y en un minuto, por el contacto con una solución de fenol al 1%. El meningococo es extremadamente sensible a las bajas temperaturas, por lo que material destinado a la investigación debe remitirse en condiciones que impidan su enfriamiento.  Cuando se demora su envío al laboratorio, debe utilizarse un medio de transporte adecuado (Mofet-Young y Stewart con tioglicolato, el sistema Transgrow o Jembec con medio de Thayer-Martin modificado).

Durante la infección se localiza en la nasofaringe, desde la que penetra en los vasos linfáticos y la sangre, produciendo una bacteriemia; más tarde, como resultado de la metástasis, el microorganismo se fija en las cubiertas encefálicas, en las que provoca una inflamación aguda, purulenta, de las meninges cerebrales y de la médula espinal.

La enfermedad comienza, generalmente, de manera repentina, con la aparición de temperatura elevada, vómitos, rigidez de los músculos de la nuca, cefalalgias intensas e hipersensibilidad cutánea. A causa del incremento de la tensión intracerebral, se desarrollan paresias de los nervios craneales. Las pupilas de los enfermos están dilatadas, hay perturbación de la acomodación y otras manifestaciones. El líquido cefalorraquídeo está turbio, contiene gran cantidad  de leucocitos y sale a presión, al hacerse la punción, a consecuencia de su tensión elevada.

En muchos casos aparece una sepsis, en la que se encuentra el meningococo en la sangre, en las articulaciones y en los

Sepsis meningocóccica

pulmones. En la propagación juega un rol importante la densidad de la población. Durante el periodo epidémico, por cada enfermo se encuentra un número elevado de portadoras de gérmenes; en los periodos fuera de als epidemias, el número de portadores de gérmenes aumenta en primavera y en otoño. Tienen una cierta importancia la resistencia del organismo, el número y la virulencia de los microorganismos, de los que depende el carácter esporádico o epidémico de la propagación de la enfermedad.

La meningitis también pueden ser provocadas por otros microorganismos patógenos (estreptococos, neumococos, estafilococos, bacterias de la influenza, las micobacterias tuberculosas y algunos virus), pero todos ellos dan lugar a casos aislados, mientras que el meningococo suele ser causa de meningitis epidémica. El padecimiento de la enfermedad se acompaña de la formación de aglutininas, precipitinas, opsoninas y anticuerpos anticomplementarios. Son muy raros los casos de repetición de la enfermedad en un individuo.

Para estudiar este microorganismos se utiliza el líquido cefalorraquídeo, las secreciones faríngeas, la sangre y los órganos de los cadáveres. Algunas metodologías que podemos aplicar son: 1) investigación microscópica del sedimento del líquido cefalorraquídeo; 2) siembra del sedimento del líquido cefalorraquídeo, de la sangre o de las secreciones faríngeas en caldo ascítico y en agar sangre-sangre o agar ascítico, para estudiar los cultivos obtenidos en cuento a sus características enzimáticas y serológicas, así como para diferenciarlos de los micrococo catarral (Neisseria catharrhalis) y de los saprófitos de la garganta. Los meningococos fermentan la glucosa y la maltosa, mientras que la Neisseria catharrhalis no fermenta los hidratos de carbono y la Neisseria sicca descompone la glucosa, la levulosa y la maltosa; 3) se practica la reacción de precipitación con el líquido cefalorraquídeo.

Se puede utilizar el sedimento para efectuar un frotis que teñido por el método de Gram, revelarála presencia de un gran número de leucocitos polinucleares, con escasos diplococos gramnegativos extras o intracelulares. Con el sobrenadante se pueden practicar las reacciones de determinación de albúminas y globulinas, que son positivas y la glucorraquia que es inferior a la normal. También en el sobrenadante puede demostrarse la presencia del polisacárido capsular por reacciones de inmunodifusión o contrainmunoelectroforesis.

En los casos de faringitis o en portadores se toma el exudado retronasal con el hisopo, que se siembra en el medio selectivo de Thayer-Martin con adición de antibiótico (vancomicina, colistina, nistatina y trimetopim) que inhiben el desarrollo de la flora asociada, pero que permite el desarrollo de N. lactamica.

En agar sangre se desarrollan colonias lisas y transparentes, a veces mucoides de 1-2 mm de diámetro, no hemolíticas, que dan la reacción de la catalasa y de las oxidasas, pues, al añadir a la placa una solución de tetrametilparafenilendiamina o tomar una colonias con el asa de cultivo y depositarla en papel filtro impregnado del reactivo, este adquiere un color negro púrpura característico, que sólo presenta la Neisseria y algunas bacterias grampositivas. N. meningitidis no se desarrolla en medios comunes, descomponen la glucosa y maltosa por oxidación, no fermentala lactosa, es negativa para la prueba de ONPG y no reduce los nitratos. El diagnóstico de especie y la clasificación en serogrupos pueden efectuarse rápidamente por aglutinación con los ueros grupoespecífico correspondientes y también por coaglutinación o inmunofluorescencia.

La mayor frecuencia de la enfermedad se registra en África subsahariana, que va desde Senegal (oeste) hasta Etiopía (este). En la temporada epidémica de 2009, 14 países africanos que reforzaron la vigilancia notificaron 78,416 casos sospechosos, 4053 de ellos mortales, que es la cifra más elevada desde la epidemia del 1996. El 6 de diciembre un comunicado de prensa notificó sobre una nueva vacuna conjugada contra los meningococos del grupo A desarrollada específicamente para África.

Según este comunicado, la nueva vacuna presenta varias ventajas respecto de las que se han utilizado hasta ahora contra las epidemias de meningitis en África: protege a los niños incluso de un año de edad y se espera que los proteja durante mucho más tiempo que la vacuna que se utiliza actualmente y que reduzca las tasas de infección y contagio.

Fuente:

Academia de Estudios MIR S.L. (AMIR) 2008, Infecciosas y Microbiología, 3ra Edición, Ed. Grafinter S.L.

OMS 2010, Nueva vacuna contra la meningitis para África, [online], disponible en:http://www.who.int/features/2010/meningitis_vaccine/es/

Piatkin K 1968, Microbiología, Ed. MIR, Moscú, Rusia.

Pumarola A, Rodríguez-Torres A, García-Rodríguez JA, Piédrola-Angulo G, Microbiología y Parasitología Médica, 2da Edición, Ed. Salvat, Madrid, España.

Pruebas Microbiológicas para E. coli

Más de un estudiante ha pasado por la situación, de no conocer exactamente que medios son los indicados para identificar

E. coli – Salmonella Shigella Agar

una cepa bacteriana específicamente, aunque haya revisado el tema en clases recientes. Por ello es práctico conocer sobre qué tipo de medios las bacterias se diferencian de otras cepas aunque sean metabólicamente muy similares. En este apartado revisaré las pruebas más relevantes para identificar a la muy estudiada Escherichia coli.

Cuando recibimos una muestra es importante definir el algoritmo de pruebas que debe manejarse para lograr identificar el microorganismo de interés. La tinción de Gram nos permite definir si el microorganismo es Gram positivo o Gram negativo en este caso en el frotis debemos observar bacilos Gram negativos para seguir a las siguientes pruebas de caracterización.

E. coli – MacConkey

La mayoría de los microorganismos pueden cultivarse sobre substratos nutritivos para el estudio de sus propiedades o para la utilización de ciertas propiedades en condiciones controladas. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos dónde intervienen factores físicos como: temperatura, pH, el factor redox entre otras.

Al momento de tener una muestra en donde se desee identificar la presencia de E. coli hay que definir que medios de cultivo son selectivos para enterobacterias. Los medios selectivos son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas que poseen una flora abundante.

Los medios selectivos incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo bacteriano que no sea de interés pero en cambio permite el crecimiento de otros grupos.

Para microorganismos entéricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagación  de los bacilos entéricos Gram negativos.

E. coli- Agar EMB

Otra tipos de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificación de microorganismos entéricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes químicos e indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

  • Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas, como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
  • Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
  • Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
  • Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico.

Pruebas Bioquímicas son  la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:

  • Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.
    • Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad para la producción de H2S en cepas de E. coli.
  • Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba detecta la producción de  la enzima β-galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos que no la utilizan. La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa, el cual es  inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
    • E. coli es positiva para esta prueba
  • Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la cual produce la hidrólisis de la gelatina.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de glucosa.
    • 99% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.
    • esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
  • Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima fenilalanina desaminasa es útil para diferenciar inicialmente a las especies de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos gram negativos.
    • 0% de positividad para cepas de E. coli.
  • Producción de descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas especies bacterianas poseen enzimas que tienen la capacidad de descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos entre ellos la arginina, lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina y CO2.
    • 17% de positividad para Arginina.
    • 90% de positividad para Lisina.
    • 65% de positividad para Ornitina.
  • Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.
    • 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptofano.  Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.
    • 98% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.
    • 1% de positividad para cepas de E. coli.
  • Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas bacterias de utilizar el malonato como fuente de carbono y energía.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el nitrato a nitrito o gas. Es útil en la identificación de la familia Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos otros grupos de microorganismos.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo de base púrpura de bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una concentración del 1% para la determinación de la fermentación de carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
    • D-Sorbitol 94% de positividad.
    • Lactosa 95% de positividad.
    • Sacarosa 50% de positividad.
    • D-Manitol 98% de positividad.
    • D-Adonitol 5% de positividad.
    • L-Arabinosa 99% de positividad.
    • Maltosa 96% de positividad.

Fuente:

Rojas N, Chaves E, García F (2006) Bacteriología Diagnóstica, Costa Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología.

García R, Córdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria

Imágenes:

Cabronio 5.9, Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas, http://es.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas

¡Brote de E. coli en Europa!

En estas semanas se han emitido constantes reportes en noticiarios y medios escritos sobre el brote de E. coli que afecta actualmente a Europa.  En Alemania este brote ha causado 18 muertes y se ha expandido a otros 11 países.

Escherichia coli

Escherichia coli

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reportado que se ha identificado una mutación en la cepa de E. coli causante de los brotes.

Según el portavoz de la OMS Aphaluck Bhatiasevi:  “Esta mutación nunca ha sido vista anteriormente en un brote”. Este nuevo brote de E. coli ha enfermado alrededor de 1.600 personas dentro de las cuales 499 sufrieron alguna complicación.

La Escherichia coli, ha sido parte de un sin numero de ensayos de más de un estudiante de pregrado, es parte de nuestra flora normal y no deja de ser interesante el hecho de que ante ciertas circunstancias logre volverse en un asesino potencial.

El género Escherichia se compone de cinco especies, de la cual la E. coli, es la más conocida y más relevante a nivel clínico. Esta bacteria es asociada a varias enfermedades como septicemias, meningitis y gastroenteritis.

Se han descrito un gran número de antígenos como: O, H y K, los cuales se utilizan para clasificar a las cepas con fines epidemiológicos. Algunos serogrupos presentan una mayor virulencia.

Dentro de los factores de virulencia  de las cepas de E. coli están:

  • Las adhesinas: Es la capacidad de adherencia a las células en ciertas localizaciones para evitar ser eliminado por el efecto de arrastre de la orina en el caso de que se encuentre dentro del aparato genitourinario. Las cepas de E. coli poseen una variedad de adhesinas especializadas como: factores de antígenos del factor de colonización,  fimbrias de adherencia y agregación, pili que forma haces, intimina, pili P, proteína Ipa y fimbrias Dr.
  • Las exotoxinas:  Entre las toxinas producidas por la E. coli podemos mencionar la Shiga Toxina, las toxinas termoestables y las toxinas termolábiles.  En el caso de las hemolisinas tienen una gran importancia en la patogenia de la enfermedad producida por la E. coli uropatógeno.

Cuando una persona adquiere una infección por E. coli puede sufrir algunos de los siguientes eventos clínicos:

  • Septicemia: en este caso tenemos infecciones que provienen del tracto gennitourinario o digestivo. Existe una alta mortalidad asociada a la septicemia en especial cuando esta afectada la inmunidad, o cuando está involucrado el abdomen o el sistema nervioso central
  • Infección del aparato urinario: Este tipo de infecciones se originan en el colon donde desciende y contamina la uretra y de ahí asciende hasta la vejiga, donde puede migrar hasta el riñón o la próstata. La mayoría de las cepas tienen el potencial de generar este tipo de infecciones, son ciertos serogrupos los que generan con mayor frecuencia este tipo de infección específicamente. Estos serogrupos tienen una mayor virulencia por su capacidad de producir adhesinas, las cuales se unen a las células que recubren la vejiga y el aparato urinario superior y por las hemolisinas que lisan las hematíes y otro tipos de células conllevando a una respuesta inflamatoria.
  • Meningitis neonatal: La E. coli  junto a los estreptococos del grupo B son los agentes causales de las infecciones del sistema nervioso central en los niños menores de 1 mes. Un porcentaje de las cepas de E. coli poseen el antígeno capsular K1. En mujeres embarazadas y en los recién nacidos este microorganismo está presente en el aparato digestivo, pero se desconoce el mecanismo por el cual este serogrupo ocasiona la enfermedad en los neonatos
  • Gastroenteritis: Las cepas que ocasionan la gastroenteritis se subdividen en:
    • E.coli enteropatógena (ECEP): Esta cepa afecta el intestino delgado. Es el gente causal de la diarrea infantil en países subdesarrollados; en este caso se observa una diarrea acuosa y vómitos. No hay heces sanguinolentas. La infección se caracteriza por la adhesión bacteriana a las células epiteliales del intestino delgado con la destrucción posterior de las microvellosidades (histopatología por unión/borrado [U/B]).
    • E. coli Enterotoxígena (ECET): Esta cepa afecta el intestino delgado. Esta cepa causa la conocida diarrea del viajero, diarrea infantil en países subdesarrollados, diarrea acuosa, vómitos, espasmos abdominales, náuseas, febrícula. Los mecanismos de patogenia de esta cepa  son las enterotoxinas termoestables y/o termolábiles, mediadas por plásmidos que estimulan la hipersecreción de líquidos y electrolitros.
    • E. coli Enterohemorrágica (ECEH): Esta cepa afecta el intestino grueso. Inicialmente causa una diarrea acuosa, seguida con una diarrea sanguinolenta (colitis hemorrágica) con espasmos abdominales; sin fiebre o con febrícula. Puede progresar a síndrome hemolítico urémico. En esta cepa la patogenia esta mediada por las Shiga Toxinas (Stx-1, Stx-2), que interrumpen la síntesis de proteínas. Causa las lesiones U/B en las células epiteliales y posee un plásmido de 60 MDa que transporta genes de otros factores de virulencia. Hay destrucción de la microvellosidad intestinal, que da lugar a la disminución de la absorción.
    • E. coli enteroinvasiva (ECEI): Esta cepa se aloja en el intestino grueso, es común en países subdesarrollados. Puede presentar fiebre, espasmos, diarrea acuosa, puede progresar a disentería con escasas heces sanguinolentas. En este caso la invasión esta mediada por un plásmido y destrucción de las células que recubren el colon.
    • E. coli enteroagregativa (ECEA): En esta cepa el lugar de acción es el intestino delgado. Causa diarrea infantil en países subdesarrollados, diarrea del viajero, diarrea acuosa persistente con vómitos, deshidratación y febrícula. La patogenia esta mediada por la adherencia agregativa de los bacilos por un plásmido con acortamiento de las microvellosidades, infiltración mononuclear y hemorragia; también se observa una  disminución en la absorción de líquidos.

Observando la gran variedad de cepas con alto grado de virulencia, es momento de analizar si el agente causal de la enfermedad en Europa será un candidato para pertenecer a esta lista de cepas con nuevas características en cuanto a inmunidad y patogenicidad.

 

Fuente:

Murray PR, Rosenthal KS, Pfaüer MA  (2006) Microbiología Médica, 5ta Ed., Madrid, España: Elsevier España S.A.

Xinhua (2011)  OMS indica que brote de E. coli en Europa es provocado por nueva mutación, La Estrella Online,http://www.laestrella.com.pa/online/al_minuto/2011/06/02/al_min_oms_indica_que_brote_de_e_coli_en_europa_es_provocado_por por_nueva_mutacion.asp, consultado el 7 de junio de 2011.

Infecciones Comunes en Psittaciformes

Vista de un loro (Amazona ochrocephala) desde mi balcón, estas aves son propensas a sufrir de las infecciones descritas en este artículo/ Lizzi Herrera

El ser humano se encuentra en contacto día a día con las aves, ya sea en el parque, en sus casas, en su lugares de trabajo pero no muchos conocen sobre las enfermedades que pueden afectar a estos animales y cuales pueden llegar a ser zoonóticas.

Existe alrededor de 20 enfermedades en aves que son zoonóticas entre ellas puede haber diversos microorganismos entre los que destacan:

Las enfermedades Bacterianas donde los agentes causales pueden formar parte de la flora normal que bajo ciertas circunstancias  pueden generar una infección.

  • En general, las infecciones bacterianas en loros están asociadas con bacterias gram negativas. Los signos clínicos varían de acuerdo a la parte anatómica afectada. Por ejemplo podemos mencionar la diarrea que surge de una enteritis, secreción nasal de la sinusitis, disnea de la neumonía, tejido inflamado o un absceso de infecciones en la piel entre otras. Un diagnostico se realiza a través de una biopsia o un estudio citológico del área afectada que debe  mostrar  las bacterias dentro de las células blancas. También puede emplearse como diagnóstico, los cultivos aeróbicos y anaeróbicos del área afectada que muestran en el medio un crecimiento que debe ser consistente con los signos clínicos observados en la ave. Como diagnóstico auxiliar se puede aplicar un análisis sanguíneo donde se realice un conteo de las células sanguíneas.
  • Clamidiosis (Psitacosis): En este caso el agente causal de la enfermedad es Chlamydophila psittaci. En la clamidiosis hay varios signos clínicos variables los cuales puede abarcar desde la disnea,  biliverdinuria, anorexia y letargo. El diagnóstico se puede hacer de diferentes formas ya que existe una variedad de pruebas incluyendo el análisis de antígenos en heces (sondas de ADN, ELISA), en sangre (sondas de ADN) y pruebas de anticuerpos  en suero (IFA y EBA). En el caso de que se obtenga un resultado positivo en el análisis de antígeno en heces, sugiere que el ave está excretando el organismo en las heces  y que es contagioso. Un resultado positivo en análisis de antígeno en sangre sugiere que el microorganismo se encuentra en el sistema ciruclatorio y que el ave se encuentra en una infección activa. En el caso de los análisis del suero este nos indica si el ave estuvo en contacto con el agente patógeno mas no necesariamente si actualmente está infectado. Otros diagnósticos auxiliares pueden ser el conteo de células sanguíneas, radiografías, perfil químico (pruebas que incluyan AST, LDH y ácidos biliares).
    El tratamiento sugerido es deoxiciclina. Como esta enfermedad es zoonótica se puede transmitir al ser humano y por lo tanto deben consultar un médico si su mascota obtiene un resultado positivo a este patógeno.
  • Clostridiosis: En esta enfermedad el agente causal es el Clostridium spp.  Esta bacteria es anaeróbica  que puede presentar signos clínicos como olores fétidos en la diarrea, el cual puede estar acompañado con gas. Para diagnosticar esta enfermedad, se requiere realizar una tinicón de gram a las heces; en caso positivo observaremos bacterias gram positivas relativamente grandes de aproximadamente  3 micrones. En ocasiones observaremos esporas en el centro o al final del bacilo. También puede realizarse un cultivo.
    Como tratamiento se indica clindamicina o otra drogas que sean efectivas contra microorganismos anaeróbicos.

Periquitos (Brogoteris juglaris) que visitan mi balcón / Lizzi Herrera

También puede haber enfermedades causadas por hongos:

  • Aspergilosis: El agente causal es el Aspergillus flavus o fumigatus. Los signos clínicos incluyen disnea o pérdida de voz. Esta enfermedad puede ser diagnosticada a través de pruebas serológicas para detectar anticuerpos y antígeno para Aspergillus, electroforesis del plasma, radiografías, endoscopía rígida para visualizar alguna masa en los sacos aéreos o en la bifurcación de la tráquea y por cultivo que evidencien presencia del hongo. Entre los diagnósticos auxiliares está el conteo de células sanguíneas.
    Como tratamiento para la aspergilosis, están las medicaciones antifúngicas como itraconazole, ketaconazole o anfotericina – B. El intraconazol esta contraindicado para el loro gris Africano, en este caso se debe emplear un tratamiento alternativo.
  • Candidiasis: El agente causal es el hongo Candida albicans. Los signos clínicos pueden ser regurgitación, diarrea, anorexia, retraso en el vaciamiento del buche y un olor agridulce en el contenido del buche.
    El diagnóstico se realiza a través de la tinción de gram a partir de las heces o a partir del buche donde se observen teñido en violeta al organismo con una morfología de células levaduriformes con más de tres células con brotes por campo con un aumento de 40X.
    El tratamiento sugerido en casos de candidiasis incluyen niastatina (actúa a nivel tópico en todo el tracto gastrointestinal) o ketoconazol si la infección es severa y ha invadido la mucosa.

Periquitos (Brogoteris juglaris) junto a un Azulejo (Thraupis episcopus)/ Lizzi Herrera

También en estas aves pueden adquirir enfermedades virales como:

  • Enfermedad del pico y las plumas de los psitaciformes (PBFD): El agente causal es un circovirus. Los signos clínicos incluyen distrofia y pérdida de las plumas y a veces necrosis en el pico. Las especies del viejo mundo (cacatúas, cockatiels, loro agapornis, loro gris africano) son las especies más susceptibles a este virus. El PBFD puede tener un tiempo largo de incubación. Las aves pueden infectarse y diseminar el virus a otras aves mientras luce clínicamente normal por años. El diagnóstico se realiza a través de análisis de sangre utilizando pruebas que emplen sondas para ADN y/o hibridización in situ al ADN en una biópsia del folículo de una pluma.
    Actualmente no existe un tratamiento. Se ha descrito recientemente en periquitos el virus PBFD-2, en el cual las aves se recuperan de la enfermedad. La prueba para analizar el PBDF-2 está disponible. Un rápido diagnóstico significa un mejor pronóstico.
  •  Virus del Polioma: El agente causal de esta enfermedad es el polioma virus. Las aves jóvenes son afectadas usualmente, pero también puede afectar a aves adultas. Los signos clínicos en la mayorías de las especies de loros (a excepción de los periquitos) son: retraso en el vaciamiento del buche, anorexia, letargo y hemorragias subcutáneas.
    La prueba definitiva ante la sospecha por los signos clínicos es la detección en heces del ADN viral o a paritr de tejidos de necropsia.
    No existe tratamiento. Hay disponible en el mercado una vacuna para loros. Se administran dos vacunas cada dos semanas para una protección óptima. Las aves tienen una máxima protección a las 2 semanas de la segunda vacuna. La primera vacuna se administra generalmente a los 35 días de edad, aunque se puede comenzar a una menor edad si es necesario.
  • La enfermedad de Pachecho: El agente causal es un virus herpes. Los signos clínicos incluyen una muerte súbita y en la necrosia se observa hígado grande y oscuro.
    El diagnóstico se realiza a través un ensayo de anticuerpos fluorescentes a partir del hígado de la necropsia. Los ensayos para anticuerpos en el suero están disponibles y los resultados positivos indican que el ave ha estado expuesta, pero un resultado positivo no diferencia entre una infección activa o latente. Una prueba negativa a anticuerpos puede ocurrir en aves con la enfermedad en curso.
    No existe tratamiento pero la mortandad puede disminuir ante un brote si se administra una droga la aciclovir al resto de la bandada.
  • Síndrome de Dilatación Proventricular (PDD): El agente causal es un virus de 89 micrones no definido. Los signos clínicos incluyen una severa pérdida de peso a pesar de un voraz apetito, alimento sin digerir, retraso en el vaciamiento del buche o poco o ningún movimiento del buche.
    El diagnóstico definitivo para esta enfermedad se realiza a través de una biopsia del buche donde se aplicaran técnicas histopatológicas para determinar si hay ganglioneuritis linfoplasmocítica.
    No existe tratamiento. En las radiografías se puede observar proventriculitis dilatada lo cual es un diagnóstico sugestivo, pero varias enfermedades en aves pueden causar este signo clínico por lo que no es un diagnóstico definitivo para PDD.

Brogoteris juglaris/ Lizzi Herrera

En este tipo de aves existe enfermedades causadas por organismos que aún no se han clasificado entre ellas podemos mencionar:

  • Lesiones cloacales papilomatosas: Se cree que el agente causal es un virus herpes. Los signos clínicos incluyen masas verrugosas en la cloaca y a veces en diversos sitios del sistema gastrointestinal como la cavidad oral.
    El diagnóstico se realiza visualmente o a través de una biopsia.
    Existe varios tratamientos incluyendo cauterización química con nitrato de plata en la mitad de la lesión, rotando los lados semanalmente hasta que desaparezca; como un tratamiento sugerido. Pero la enfermedad no se considera curable. Si la enfermedad de hecho  es causada por un virus herpes, el aciclovir puede servir como tratamiento.
  • Megabacteria: El agente causal es un organismo de 90 micrómetros de largo, se cree que puede ser un hongo. Los signos clínicos pueden incluir regurgitación o ningún signo visible.
    El diagnóstico se realiza a través de la observación del organismo en una tinción de gram de las heces o un frotis directo histopatológico de una biopsia/necropsia.
    El tratamiento para esta enfermedad es anfotericina – B.

Fuente:

Ballard B, Cheek R (2001) Exotic Animal Medicina for the Veterinary Technician, Iera Ed., Iowa: Ed. Blackwell Publishing Company