¿Hemoglobina en Plantas de Tabaco?

Mucho se ha hablado de los transgénicos y no podemos evitar caer el típico ejemplo de el maíz genéticamente modificado, el cual se ha convertido en un clásico en el tema de transgénicos. En el año de 1997 en Francia se realizó un notable ensayo para producir hemoglobina en plantas de tabaco con la esperanza de producir sangre artificial manipulando genéticamente plantas de tabaco.

Las expectativas para aquel entonces era contar en cinco años una producción industrial de la “sangre verde” de forma abundante y barata disponible en todo el mundo; 14 años después ante la curiosidad inevitable de reseñar e investigar sobre este trabajo y ver los resultados actuales deja un sabor amargo ver el poco avance desde entonces.

Esta investigación fue llevada a cabo por investigadores del “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale” (INSERM), a través de la ingeniería genética, se logró que una planta de tabaco produjera hemoglobina. Esta hemoglobina es esencial para el trasporte de oxígeno de los pulmones a todos los tejidos del organismo.

En este artículo se hace mención a  un estudio realizado por un grupo japonés liderado por el investigador H.T. Naito, de la Universidad de Osaka quienes hacen los primeros estudios sobre compuestos con la capacidad de transportar oxígeno en el torrente sanguíneo; el fruto de este estudio es una serie de perfluorocarbonos, que son hidratos de carbono en los que todas las moléculas de carbono se remplazan por flúor: un compuesto totalmente inerte. Este compuesto al igual que la hemoglobina tiene la propiedad de tomar oxígeno al pasar por los pulmones y de descargarlos en todos los tejidos. Al igual que la sangre, se cargaba con anhídrido carbónico que se eliminaba al llegar a los pulmones. Al llevar este compuesto para realizar diversos ensayos se observó que no era enteramente inocuo y el precio era demasiado elevado como para pretender comercializarlo.

Actualmente estos compuestos se han aplicado en medicina en especial el Perflubron para diversas áreas:

  • Es un excelente medio para transportar gases respiratorios, puede transportar a una atmósfera de presión 20 veces más oxígeno que la salina.
  •  Puede usarse como surfactante en infantes prematuros.
  • Puede usarse en el tratamiento de lesiones pulmonares subagudas y subagudas (ARDS).
  • Remueve cuerpos extraños en caso de edema pulmonar

Regresando a la sangre verde, las expectativas para esta producción era obtener mejores precios y rapidez en el proceso de producir hemoglobina pero el producto que se obtiene en el tabaco es incompleto, ya que esta sangre vegetal no posee glóbulos blancos ni plaquetas. En principio según los investigadores esta sangre no presenta ningún riesgo de infección ni problemas de compatibilidad, es fácil de transportar y de conservar, sería de gran ayuda en casos de hemorragia masivas y en pacientes que requieran constantes transfusiones.

En este trabajo se logró sintetizar las proteínas de las dos cadenas alfa y la beta. Una vez logrado esto introdujeron esas proteínas en una planta de tabaco, que para los ingenieros genéticos tiene la misma funcionalidad que un cobayo de laboratorio para estos estudios. La síntesis de estas proteínas se hacen a partir de genes, que son segmentos del ADN . El ADN es una molécula que se encuentra en el núcleo de las células. Todos los genes están constituidos por un conjunto de pequeñas unidades que reciben el nombre de nucleótidos.

Los investigadores franceses reconstituyeron dos genes sintéticos, capaces de incorporarse a una célula de tabaco. Agregaron en las extremidades de cada uno un iniciador  y un finalizador que pudieran ser reconocido por la maquinaria celular de la planta. Obtuvieron así, dos genes completamente artificiales, que luego fueron puestos uno al lado del otro. Hecho eso, la última parte del experimento consistió en trasferir ese montaje genético a las células de una hoja de tabaco aisladas previamente. Esto se realizó a través de un vector, un agente que permitiera la unión, como vector se eligió al Agrobacterium tumefaciens, que es una bacteria del suelo responsable de la proliferación celular en áreas como el tallo y las raíces. Esta bacteria se escogió porque tiene una característica muy ventajosa para estos trabajos ya que transfiere naturalmente su material genético a las células vegetales.

En términos más simples, la información genética de la hemoglobina fue introducida en la bacteria, que a su vez la introdujo en las células del tabaco. Estas a su vez integraron a su propio patrimonio la información genética que llevaba las instrucciones necesarias para la síntesis de hemoglobina. Por supuesto la síntesis se hace en el citoplasma de las células de tabaco. Al multiplicarse, las células de la planta transmitieron a sus descendientes la información genética que ellas habían heredado.

1) De una médula ósea se toman los eritoblastos 2) Las células que dan origen a los glóbulos. El ADN de estas células contienen los dos genes 3) de la síntesis de la hemoglobina se agregan un iniciador y un finalizador 4) Estos son introducidos dentro de la E. coli para que se multipliquen y se recurre a la A. tumefaciens 5) El Plásmido 6) Transporta esos genes 7) dentro de las células del tabaco donde se integran al ADN


El siguiente paso era conocer en qué parte de la planta del tabaco se había alojado en mayor concentración estas nuevas células cargadas de hemoglobina. Las respuestas las dio un estudio hecho con rayos láser concluyendo que: las semillas y las raíces eran las partes donde se habían agrupado estas nuevas células transgénicas. El resto del estudio fue más simple ya que a través de un proceso industrial manejado por un cromatógrafo se extrajeron las proteínas de la planta. Aunque su rendimiento es aún bajo, se esperaba que en los próximos años obtener cantidades más significativas.

8) Los genes 9) sintetizan los dos tipos de cadenas de proteínas propias de la hemoglobina 10) los cuales captan, dentro de los cloroplastos, un grupo de los pigmentos ferrosos 11) Luego las cadenas se asocian de dos en dos para formar las moléculas de la hemoglobina 12) Las células vegetales colocadas en cultivo 13) Regeneran las plantas de tabaco transgénico 14) cuyas semillas serán utilizadas para extraer hemoglobina

En teoría la propuesta de este trabajo es interesante en el plano científico pero a la  hora de llevarlos a estratos más comerciales, cuando hay  de equiparar procesos a niveles industriales observamos que muchos de estos trabajos y proyectos de investigación pierden funcionalidad. Generalmente los institutos, universidades, centros de investigación cambian de línea de trabajo. A veces el trabajo puede presentar una buena propuesta pero es interesante como el temor de algunos analistas hace que la opinión pública no acepte comer alimentos transgénicos; ahora para a aceptar sangre transgénica se requerirá de mucho tiempo, por la tendencia observada, para que estos trabajos pueda llegar a ser funcionales en un futuro.

Fuente:

AG (1997) Sangre Verde, Revista Conozca Más

Department of Respiratory Care Education, Perfluorcarbon,  http://classes.kumc.edu/cahe/respcared/liquidventilation/wikeper.html, consultado el 27 de mayo 2011.


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¿qPCR?

Como conocemos la metodología de la PCR se puede utilizar para estimar la concentración de un ADN o ARN blanco relativo a un estándar, aunque la PCR cuantitativa (qPCR) dentro de las diferentes variantes de PCR tiene una metodología sencilla y no representa un reto a nivel técnico, puede generar complicaciones a raíz de la naturaleza de el proceso de realizar una PCR en sí.

Como la PCR es un proceso exponencial, pequeñas diferencias en la eficiencia en cada ciclo de la reacción puede generar grandes diferencias en el rendimiento de los productos de amplificación. Cualquier evento que afecte la amplificación exponencial puede comprometer la cuantificación de las secuencias blanco entre ellas podemos mencionar: la presencia de inhibidores en una serie de muestras que contenga la misma cantidad de templado de ADN puede dejar diferencias en el rendimiento final del producto amplificado, también puede afectar al proceso las diferencias en la eficiencia entre los primers empleados para amplificar el estándar y las secuencias blanco.

La qPCR actualmente a través del avance de la tecnología ha logrado mejorar el rendimiento del proceso a través de metodologías automatizadas y esto ha eliminado muchas de las variaciones asociadas con la medición del punto final.

Al comienzo se empleaba una metodología para la qPCR que involucraba comparar la cantidad de producto específico generado en diferentes muestras de una muestra blanco en particular. En esta técnica, las cantidades de producto amplificado fueron medidos en varios tiempos durante la fase exponencial de la reacción y fueron analizado por regresión lineal. Cuando todo sale bien dentro del proceso, este método podía ser usado para detectar concentraciones picomolares de la secuencia blanco y era suficientemente exacta para distinguir la diferencia en el doble de la concentración de la secuencia blanco en diferentes muestras. La falla de este método radica en la variación de tubo a tubo, por esta razón no es usada comúnmente.

Dos tipos de controles se pueden utilizar para monitorear la variabilidad de tubo a tubo: el estándar endógeno y referencias externas adicionadas.

  • Estándar endógeno: son secuencias de control (usualmente genes housekeeping o sus ARNm) que están presentes en la misma preparación de DNA o RNA que la secuencia blanco. La cuantificación se hace por la comparación de las cantidades de productos amplificados generados por el estándar endógeno y la secuencia blanco. Este método funciona bien si el producto amplificado se mide durante la fase exponencial de la reacción, si la referencia y las secuencias blanco son amplificadas con igual eficiencia si estas están presentes en la muestra a concentraciones aproximadas. Aunque estas condiciones no se cumplen generalmente porque los productos amplificados son casi siempre diferentes de las referencias endógenas en tamaño, secuencia y abundancia. Estas incongruencias entre el blanco y la referencia se manifiestan como diferencias sistemáticas en la eficiencia de la amplificación entre dos ácidos nucleicos. No se garantiza que los genes housekeeping escogidos como estándar endógeno sean invariable en su nivel de expresión de una muestra a otra. Los niveles de expresión de estos genes no son constantes de un tejido de mamífero a otro ni de una línea celular a otra. La diferencia en la cantidad de producto amplificado generado por la referencia y el blanco puede entonces resultar de la amplificación diferencial o de cambios en los niveles de transcripción del gen blanco y/o el gen estándar o de ambos.
  • Moléculas de referencia adiciondas externamente son ADN o ARN que son adicionadas en cantidades conocidas a una serie de reacciones de amplificación. Como los templados de referencia y las secuencias blanco están presentes en la misma reacción de amplificación, usan los mismos primers, el efecto de las variables mencionadas al principio se anulan. La cuantificación se logra por la comparación de las cantidades de productos amplificados generados por la secuencia de referencia y la secuencia blanco. El propósito del experimento para averiguar la relación de la secuencia de referencia con la secuencia blanco en la mezcla de la reacción en el ciclo cero puede lograrse de dos formas. Una serie de reacciones se pueden configurar conteniendo diferentes relaciones de las moléculas de referencia y moléculas blanco. Una curva se construye mostrando la relación entre la cantidad de producto amplificado y la cantidad de la referencia adicionada a la reacción . La secuencia blanco puede entonces cuantificarse por interpolación. Pero una reacción que rinde iguales cantidades de productos amplificados, la relación de las moléculas blanco a las moléculas de referencia en el comienzo de la PCR se dice que es única. Aunque esta conclusión es cierta solo si la eficiencia de la amplificación de la moléculas blanco y la referencia son iguales en todo el curso de la PCR.

La curva estándar se realiza a través de experimentos independientes al estudio.

Para eliminar la duda en los resultados analizados, actualmente se cuenta con métodos sofisticados. Estos avances involucran la cuantificación de cantidades de referencia y de secuencias blanco en ciclos consecutivos dentro de la fase exponencial de la PCR. Los productos amplificados acumulados durante esta fase sigue esta ecuación:

LogNf = n log (1 + Y) + logN0

Donde Nf es el número de copias de secuencias amplificadas después de n ciclos de amplificación, N0 es el número inicial de copias de las secuencia blanco en el templado del ADN. La eficiencia en la amplificación por ciclo está descrita por Y.

Una respresentación de un gráfico semilogarítmico de la concentración en log de un determinado producto amplificado contra el número de ciclo nos da una línea recta. La ecuación describe la acumulación del producto que puede entonces derivarse usando un análisis de regresión. En el mejor de los casos, si la secuencia blanco y la de referencia son amplificadas con una igual eficiencia, la línea de regresión será paralela una a otra. La relación entre la moléculas blanco y de referencia puede ser calculada de la intersección de las líneas con un ciclo sencillo medio exponencial.

En el gráfico observamos que se muestran los datos como concentración del producto vs número de ciclos en una representación semilogarítmica con su respectiva líneas de regresión.

Fuente:

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3era Edición, New York, Ed: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Genética en Plantas I

Cuando hablamos de genética no podemos evitar pensar en los estudios realizador por Gregor Mendel, evaluando factores hereditarios en los guisantes que cultivaba en su jardín. Entre algunos factores hereditarios encontrados en los guisantes analizados por Mendel están: el color de las flores, la posición de las flores, la forma de la vaina, la longitud del tallo, color de la semilla, la forma de la semilla entre otras.

Ahora se conoce que todos estos factores hereditarios están determinados por los genes; los genes son secuencias de ADN que codifican las moléculas de ARN directamente involucradas en la formación de enzimas y proteínas estructurales de la célula. Los genes se encuentran arreglados de forma lineal en los cromosomas.

Desde que Mendel descrubrió en su jardín los principios de la genética se ha establecido firmemente que las respuestas del más simple microorganismo al crecimiento, desarrollo y el ambiente está determinado por la expresión programada de sus genes.

Entre los organismos multicelulares la expresión de genes altera los complementos enzimáticos y proteínas estructurales de la célula , permitiendo a la célula diferenciarse. Varias señales internas son requeridas para coordinar la expresión de los genes durante el desarrollo y para permitir que la planta responda a señales ambientales.

Tanto agentes de señalización internos como externos normalmente logran sus efectos por medio de secuencias de reacciones bioquímicas, llamadas vías de transducción de señales, que en gran medida amplifican la señal original y en la última instancia resulta en la activación o represión de genes.

En estudios de genómica se observa que la complejidad del organismo esta directamente relacionada con el tamaño del genoma. Aunque debemos tener en cuenta que no todo el ADN en el genoma codifica para genes. El genoma de los procariotas consiste principalmente de secuencias únicas (genes). Mucho del genoma de eucariotas,  consiste de ADN repetitivo y de ADN espaciador.

Arabidopsis

El tamaño del genoma en plantas es altamente variable, el cual puede variar dentro de un rango de 1.5 x 10*8bp en Arabidopsis a 1 x 10*11bp en Trillium. El genoma de las plantas contiene alrededor de 25,000 genes, en comparación con el genoma de la Drosophila que contiene 12,000 genes.

Fuente:

Taiz L, Zeiger E (2003) Gene Expression and Signal Transduction en Capítulo 14 de Plant Physiology,  3ed., Sinauer.