Conceptos Básicos en Cultivo Celular – Equipos de Laboratorio

Cámara de flujo laminar para cultivo celular

Al momento de iniciar las prácticas profesionales, muchos estudiantes sienten algo de ansiedad a la hora de trabajar en el área de cultivo celular dada la gran probabilidad a contaminar las preciadas muestras por la falta de experiencia.

Casi siempre al investigar la fuente de la contaminación llegamos a la conclusión que algún detalle en la manipulación del operario fue la fuente primaria de la presencia de hongos y bacterias en los cultivos. Idealmente el trabajo debe ser llevado en una locación que debe estar separado en áreas de:

  • Material limpio (libre de contaminantes)
  • Material sucio (área de cuarentena, muestras).

De no ser posible el material debe ser separado por periodos de manipulación o trabajo, dónde el material limpio debe ser utilizado previamente a manipular el material sucio (muestras). Diferentes incubadoras deben ser designadas de acuerdo al tipo de cultivo que se mantiene en ellas. También las superficies de trabajo deben ser limpiadas rigurosamente entre actividades. Todo material nuevo debe ser manejado como material de cuarentena hasta que se demuestre que esta libre de contaminantes como bacterias, hongos y particularmente micoplasmas.

Llevar un cultivo de células en áreas comunes, requiere de una planeación y es esencial que se usen buenas prácticas para minimizar el riesgo de contaminación de su trabajo. La mayoría de las líneas celulares de laboratorio deben ser manipuladas en un nivel de contención nivel dos. Aunque la categoría requerida es dependiente de la línea celular y la naturaleza del trabajo que se va a realizar. Además se recomienda que los laboratorios tengan presión de aire negativo en los corredores para contener cualquier riesgo de contaminación cruzada entre laboratorios.

La cámara de flujo laminar es probablemente el equipo más importante, ya que operado de forma correcta, asegura un ambiente limpio de trabajo para los insumos, cultivos y al mismo tiempo protege al operador de los aerosoles. En estas cabinas, la protección al producto y/o operador es dado a través de los filtros HEPA (high efficiency particulate air). Los ductos de la cabina circula hacia la atmósfera o re-circula a un segundo filtro HEPA, antes de ser liberado a la atmósfera.

Se debe realizar monitoreos con agar triptona de soya y colocar los platos dentro de las cabinas por un mínimo de 4 horas, lo cual debe ser buen indicador de que tan limpias se encuentran las cabinas. No se debe reportar crecimiento de bacterias o hongos en dichos platos. En la mayoría de los casos las cabinas de clase II son adecuadas para el cultivo de células. Aunque, cada estudio debe ser evaluado los factores de riesgo probable en cada elemento adicional, como posible infección viral de fuente desconocida, podría requerir mayores niveles de contención.

Laboratorio de Cultivo Celular

Laboratorio de Cultivo Celular

Otros equipos que son relevantes en instalaciones de cultivo celular son:

  • Centrífugas: Este equipo es utilizado rutinariamente en el cultivo de células como parte de los procedimientos de sub-cultivo para la mayoría de las líneas celulares y para la preparación de la criopreservación de las células. Por su naturaleza, las centrífugas producen aerosoles y por ello, es necesario minimizar cualquier posibilidad de riesgo de exposición. Las centrífugas deben ser de tapas transparentes para que en caso de algún derrame, pueda ser ser detectado sin abrir la tapa. Esto reducirá el riesgo del operador a ser expuesto a material peligroso si la centrífuga presenta algún incidente durante el proceso. Se debe cuidar siempre de no sobre llenar los tubos y realizar el apropiado balance. Estos pasos podrán reducir el riesgo de generar aerosoles. Las centrífugas deben ser colocadas en un sitio de fácil acceso para la limpieza, mantenimiento y ser evaluadas frecuentemente para detectar signos de corrosión.
  • Incubadoras: Estos equipos son utilizados de rutina para proveer las condiciones apropiadas para el crecimiento de las células, como la temperatura, humedad y niveles de CO2 de manera controlada y estable. Generalmente deben programarse a temperaturas en un rango de 28°C (para líneas celulares de insecto) hasta 37°C (para líneas celulares de mamíferos). Algunas incubadoras tienen la facilidad para controla los niveles de oxígeno, la inclusión de tratamientos para las bandejas de baño maría en la incubadora, reducirán el riesgo de crecimiento de bacterias y hongos en las bandejas de agua. Aunque no hay sustituto a la limpieza frecuenta de la incubadora.

Fuentes:

  1. Sigma Life Science (2012) Cell Culture Manual 2011-2014, Technical Information, SIGMA-ALDRICH, 308-309.
  2. Basant Kumar Sinha, Rinesh Kumar (2008)Principles of Animal Cell Culture, 65-68,International Book Distributing Co.
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Identificación Bioquímica de Salmonella spp.

Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium

La identificación de Salmonella spp., es de gran importancia en la industria alimentaria (desde la planta de producción hasta la planta de procesamiento), para reducir la probabilidad de contaminación en alimentos, especialmente cuya fuente sea avícola.

Para la identificación de una bacteria es requerida la aplicación de pruebas bioquímicas, especialmente las pruebas que involucran el metabolismo bacteriano, dónde las enzimas características de cada cepa revelen la identidad de la bacteria a describir.

La identificación bioquímica de una bacteria se conoce como batería bioquímica, dónde se emplea una serie de tubos con medios especiales en los que se va evaluar el metabolismo de la bacterias y las enzimas presentes y ausentes.

El primer paso comienza al lograr aislar las colonias sospechosas de ser de Salmonella spp., éstas deben ser transferidas con un asa bacteriológica en punta estéril a una serie de pruebas bacteriológicas, con los medios de TSI (Triple sugar iron) y LIA (Lysine-iron agar)

El medio TSI, contiene: peptona, agar, lactosa, sucrosa, cloruro de sodio, extracto de carne, extracto de levadura, glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol. Su uso principal es para la diferenciación de miembros de Enterobacteriaceae basado en la fermentación de la lactosa, sucrosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico.

Para la preparación de LIA, se requiere de: agar, L-lisina, digesto pancreático de gelatina, extracto de levadura, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y púrpura de bromocresol, a un pH final entre 6.7 ± 0.2. Su aplicación es para el cultivo y diferenciación de los miembros de Enterobacteriaceae basado en su habilidad de descarboxilar lisina y formas ácido sulfhídrico. Las bacterias que descarboxilan lisina tornan el medio en púrpura y las bacterias que producen ácido sulfhídrico se muestran como colonias negras.

En cada prueba se debe deslizar el asa bacteriológica de forma estríada en la superficie del agar y luego introducir la punta del asa en los medios evaluados. Es importante señalar que el pase de las colonias debe realizarse a partir de una colonia bien aislada, dado que LIA y TSI, son empleadas para seleccionar bioquímicamente colonias sospechosas de Salmonella spp. Si se introduce un cultivo mixto en éstos medios, los resultados pueden ser inespecíficos.

Si las colonias sospechosas son encontradas solo es áreas cargadas de colonias mixtas  en el agar,  es prudente re-sembrar las colonias sospechosas, con el fin de obtener un cultivo puro previo a la inoculación de éstas colonias en TSI y LIA. Estos medio diferenciales deben ser evaluados después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Salmonella en TSI and LIA

Salmonella en TSI and LIA

Es particularmente importante con TSI, ya que una inclinación ácida a las 24 horas a menudo vuelve a ser alcalina con una incubación más prolongada, debido a los componentes proteicos del medio que usan después del agotamiento de los carbohidratos. Las observaciones con respecto al gas y al ácido sulfhídrico son útiles y se debe concentrar la atención en las reacciones al extremo y en la inclinación de los cultivos, independientemente si se manifiesta el ácido sulfhídrico o la producción de gas.

También debemos tener que en cuenta que las muestras de laboratorio que se envían pueden contener varios patógenos entéricos, no solo Salmonella y se pueden agregar agares selectivos/diferenciales para colectar más información para su identificación. Otros medios que se pueden utilizar además de LIA y TSI son:

  • Medio de Indol y Ornitina de motilidad (MIO)
  • Agar de Urea de Christensen
  • Citrato de Simmon
  • Motilidad de ornitina

En un aislado de Salmonella, se espera que en sus pruebas bioquímicas, esta descarboxile la lisina en LIA, fermente la glucosa anaeróbicamente en agar TSI, produzcan ácido sulfhídrico en agar TSI y en LIA. En las pruebas complementarias se espera que utilice el citrato, que tenga incapacidad para hidrolizar urea, producir indol a partir de triptófano.

Las reacciones de azúcar, comprenden la fermentación de glucosa manitol, maltosa y dulcitol y la incapacidad de fermentar lactosa, sacarosa y salicina. Estas reacciones bioquímicas se pueden llevar a cabo convenientemente en los medios compuestos para la identificación bacteriana, como el agar Kohn o  TSI.

Los cultivos que dan las reacciones bioquímicas características de las especies de Salmonella se prueban con los sueros O y H apropiados hasta que se identifican el grupo y el serotipo. Las pruebas bioquímicas para la identificación de salmonellas se pueden combinar para formar una prueba de identificación. Algunos de estos, como los sistemas API 20E o Enterotube II, están actualmente disponibles para su compra.

 

Fuente:

  1. Yousef, Ahmed Elmeleigy. (2003). Food microbiology : a laboratory manual. Hoboken, N.J. :John Wiley & Sons.
  2. Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. In Poultry Diseases (Sixth Edition) (pp. 110-145).
  3. García, M., & Silva, M. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Identificación bioquímica y tipado microbiológico. Unidad didáctica55, 346.
  4. Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2013). Handbook of media for clinical and public health microbiology. CRC Press.
  5. Atlas, R. M. (2006). The handbook of microbiological media for the examination of food. CRC Press.

Los Postulados de Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch fue uno de los más importantes bacteriólogos de todos los tiempos, trabajó como médico rural, donde comenzó su carrera científica como bacteriólogo. Su primera contribución a la microbiología fue el aislamiento de Bacillus anthracis, agente etiológico del carbunco bacteriano, a raíz de sus investigaciones sobre el Carbunco Koch enunció una serie de leyes, los Postulados de Koch, que constituyen su mayor contribución a la historia de la Microbiología.

Estos postulados se han tomado describe la etiología de todos los agentes causantes de una enfermedad infecciosa, aunque fueron utilizados originalmente para describir al Carbunco bacteriano, una enfermedad que se transmitía de forma frecuente al hombre desde el ganado lanar y vacuno. En sus investigaciones, Koch descubrió que el patógeno se encontraba siempre en la sangre de los animales enfermos, por lo que tomó pequeñas muestras de sangre de estos animales y se las inoculó a animales sanos. El resultado fue la transmisión de la enfermedad.

En una segunda fase de investigación, Koch descubrió que el patógeno podía ser aislado de los individuos enfermos, cultivándolo en el laboratorio sin perder su capacidad patogénica, ya que cuando se les inoculaba a nuevos individuos se reproducía la enfermedad. A partir de estas investigaciones propuso los siguientes postulados:

  • El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad y ausente en los sanos.
  • El agente no debe aparecer en otras enfermedades.
  • El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad
  • El agente ha de provocar la enfermedad en un animal susceptible de ser inoculado.
  • El agente ha de ser aislado de nuevo en las lesiones de los animales en experimentación.

Estos postulados describían la etiología de la tuberculosis, del cual consiguió aislar el Mycobacterium tuberculosis. Un año después aisló el Vibrio cholerae, agente etiológico de la Cólera.

Postulados de Koch

Postulados de Koch 

De este modo se establecía un protocolo para discernir entre las muchas bacterias o agente biológicos presentes en cualquier tejido de cualquier animal. Mientras que muchas bacterias aparecen como parásitos de lesiones provocadas por otros agentes, solo hay un agente que provoque realmente la lesión. La importancia de los postulados de Koch consiste en la utilización de los cultivos puros, cosa que es necesaria para discernir el verdadero causante de la enfermedad.

Aunque la mayoría de las bacterias infecciosas causantes de la enfermedad en humanos cumplen los postulados, hay algunas excepciones. Mycobacterium leprae, no se ha podido cultivar in vitro como cultivo puro, por lo que incumple el tercer postulado. Solo se ha podido cultivar in vivo en las almohadillas de las patas de un armadillo.

Actualmente los postulados de Koch constituyen la piedra angular de cualquier estudio sobre la etiología de una enfermedad y son una herramienta de vital importancia para la rápida identificación de nuevos patógenos (enfermedades emergentes y reemergentes) con el fin de aplicar tratamientos preventivos. Pese a las muchas teorías formuladas en su contra, apenas han sufrido modificación alguna conservando toda su vigencia y validez.

Fuente:

Fuentes Castillo C. (2007) Los postulados de Koch: Revisión histórica y perspectiva actual, Revista Complutense de Ciencias Veterinarias Vol. 1 (2) p.262-266.

Pineda Vásquez ME., Microbiología: Aspectos Históricos, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira.

Aislamiento de Bacterias Anaerobias

Bacterias Anaerobias

Bacterias Anaerobias

La presencia o ausencia de oxígeno, influencia fuertemente el metabolismo de los microorganismos, permitiendo clasificarlos en tres categorías  de acuerdo a la dependencia de la respiración aeróbica para su desarrollo:

  • Aeróbicos estrictos: Dependen exclusivamente de la respiración aeróbica, dónde el oxígeno es el aceptor final de electrones.
  • Anaeróbicos estrictos: el oxígeno es tóxico.
  • Anaeróbicos facultativos: Son bacterias que poseen un sistema de enzimas que les permiten utilizar oxígeno libre o alguna fuente alternativa de oxígeno como es el nitrato. Si el oxígeno esta presente, tienden a utilizarlo en preferencia a la vía alternativa. Hay microorganismos que se les considera indiferentes, porque no muestran preferencia por ninguna condición aerobia o anaerobia, pueden crecer bien en condiciones aerobias y anaerobias.
  • Microaerofilos: Son organismos que requieren oxígeno libre, pero solo en pequeñas cantidades.

Cuatro de las consideraciones más importantes en el cultivo de bacterias anaerobias son:

  1. Cultivar el material clínico inmediatamente después de obtenido.
  2. Emplear medios frescos
  3. Obtener adecuadas condiciones anaerobias.
  4. Efectuar el subcultivo de colonias inmediatamente después de sacarlas de un medio anaerobio.

Las muestras clínicas se deben cultivar inmediatamente después de colectadas pues algunos organismos anaerobios  son bastantes sensibles al ser expuestas al oxígeno y mueren rápidamente en un medio aerobio.

Se prefieren los líquidos aspirados, al material obtenido con escobillón (no permitir nunca que los materiales de los escobillones se seque).  Si no es posible cultivar una muestra de inmediato, el material debe colocarse en un medio que contenga un agente reductor como cisteína o tioglicolato a la temperatura ambiente durante un periodo que no exceda de dos horas.

Preparar y teñir frotis directos de cada muestra. Para tener idea de la cantidad y el tipo de organismo en la muestra. También puede ser útil examinar montajes húmedos de material no teñido, frotis con tinción para ácido-resistentes, y frotis teñidos con Giemsa. Empléense pipetas capilares para preparar frotis de muestras líquidas o utilícense los escobillones directamente. Importante registrar:

Tubo de ensayo .jpg

  1. La reacción al gram, el tamaño, la forma y la cantidad relativa de los organismos presentes.
  2. La presencia de esporas y su forma y posición en la célula.
  3. Cualquier características morfológica especial como ramificación, pseudo-ramificación, formación de cadenas, filamentos, cuerpos esféricos, o diminutas formas granulares.

Inocular medios primarios de aislamiento lo más pronto posible una vez recibidas las muestras:

  • Muestras líquidas: Utilizar una pipeta capilar para inocular los medios líquidos o semisólidos cerca gotas de inóculo . del fondo con 1 ó 2 gotas del inóculo. Colocar 1 gota en cada medio de cultivo en placa y sembrar por estría para lograr aislamiento.
    • Para el aislamiento de Bacteroides melaninogenicus, se debe añadir 5.0 mg de hemina y 0.5mg de menadiona (esterilizada con filtro) a cada litro de medio de cultivo para aislamiento.
  • Tejidos u otras muestras sólidas: Añadir suficiente caldo de tioglicolato para emulsionar la muestra, añadir arena estéril en cantidad necesaria y moler en un mortero. Proceder vcomo en el muestra líquida.
  • Escobillones: Colocar el escobillón directamente dentro de los medios líquidos y utilizar otro escobillón para sembrar las placas. Si es necesario, se puede preparar una suspensión inoculante enjuaguagando suavemente el inóculo de un escobillón en aproximadamente 2 ml de medio de tioglicolato.
    • Calentar todo el medio líquido y semisólido en un baño de agua hirviente durante 10 minutos y enfriarlo antes de la inoculación

Fuente:

V. R. Dowell Jr., T. M. Hawkins (1975) Métodos de Laboratorio en Bacteriología Anaeróbica, Departamento de Salud Educación y Bienestar de E.U.A., Administración de Servicios de Salubridad y Salud Mental, Centro Regional de Ayuda Técnica, México/Buenos Aires.

H. J. Benson (2002) Cultivation of Anaerobes in: Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology, 8th Edition, McGraw-Hill Higher Education, p.89.

El Virus de Mancha Blanca WSSV

WSSV - Scheme

Características y distribución del WSSV en América

El Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV), es un virus de ADN de doble cadena del género Whispovirus, familia Nimaviridae (Zhang et al 2006); cuyo genoma tiene un tamaño aproximado de 290 kpb. Este virus es uno de los microorganismos patógenos más complejos que afectan al camarón (Lightner & Pantoja, 2003).

La infección puede ser transmitida de forma vertical (trans-ovum), horizontalmente por el consumo de tejido infectado (canibalismo) y a través del agua de los estanques. Los camarones moribundos pueden ser una fuente de transmisión de la enfermedad a camarones sanos (OIE, 2008).

Se ha reportado que durante la fase aguda de la enfermedad, los camarones tienden a mostrar una reducción en el consumo de alimento, se vuelven letárgicos, la cutícula se desprende fácilmente y presentan manchas blancas de aproximadamente 0.5 a 2.0 mm de diámetro, las cuales son más evidentes en la parte interna del caparazón (Lightner & Pantoja, 2003).

Las poblaciones de camarones que presentan estos síntomas clínicos tienen a exhibir altas tasas de mortalidad acumulada, alcanzando hasta el 100%, alrededor de los 3 a 10 días posteriores a los primeros síntomas (Lightner & Pantoja, 2003). Los brotes de la enfermedad pueden ser inducidas por factores de estrés, por ejemplo: la temperatura del agua  tiene un profundo efecto en la expresión de la enfermedad, con temperaturas promedio debajo de los 30°C (OIE, 2008).

El primer brote de WSSV fue reportado en Japón en 1993 y actualmente es uno de los virus de mayor interés por su virulencia y por las grandes pérdidas económicas que genera en la industria camaronera. En Abril de 1999 se reportó el primer caso en Panamá y se ha dispersado a México, Nicaragua, Honduras, Costa Rica, Ecuador y Colombia (Lightner & Pantoja, 2003).

En Panamá después del brote inicial se obtuvo un porcentaje de supervivencia de larvas en el primer ciclo del año de un 3%, lo cual afecta gravemente la economía y la funcionalidad de las empresas camaroneras en el país (González R., 1999).

La cría científica de camarones se inició en el año de 1974, cuando la Compañía Agromarina de Panamá S.A. inicia operaciones. Las áreas donde se cría el camarón están localizadas cerca del mar en la Costa del Pacífico, siendo las más aptas aquellas que están en la parte Oeste de la ciudad de Panamá y al Este de la Península de Azuero (Pretto 1982).

Desde la aparición del WSSV en el país, se cerraron numerosas compañías dedicadas a la cría del camarón, se estimó que solo en la región de Aguadulce, los despidos ocasionados como consecuencia de los cierres de las plantas afectaron a 400 personas. Los brotes iniciales del síndrome de la mancha blanca generan mortalidades elevadas, perjudicando al 80% de la industria (González R., 1999).

Nested PCR - WSSV

Procedimiento de la PCR Anidada

Dentro de la pruebas diagnóstica se han diseñados protocolos de PCR anidado (Lo et al). Esta modalidad consiste en realizar una PCR a partir del producto de una PCR previa . Las ventajas que aporta esta metodología es aumentar la sensibilidad de la reacción, además se puede emplear como método de tipificación (Ceccotti & Sforza, 2007).

La cantidad de muestra sugerida es de 100 a 200 gramos de tejido de camarón tales como, pleópodos. Otro tipo de muestra es una cantidad mínima de 11 post-larvas (juveniles o subadultas), 10 post-larvas completas o 100 μL de hemolinfa (OIE, 2008).

Se debe cuidar que las muestras de ADN estén preparadas con los tejidos adecuados y que la temperatura de los ciclos sea la apropiada (particularmente para la hibridación, la temperatura recomendada es de 62°C). Es importante prevenir la posibilidad de resultados falsos positivos, especialmente cuando se evalúan áreas libres de la enfermedad y nuevos hospederos del WSSV (OIE, 2008).

Un resultado positivo en el primer paso de amplificación implica una infección fuerte por WSSV, mientras que un resultado positivo en la segunda amplificación muestra una infección latente o de portador. Para el diagnóstico de la incidencia de WSSV en un nuevo huésped o en un estudio en una zona libre de WSSV, se recomienda emplear la secuenciación del ADN para confirmar los resultados positivos de la PCR (OIE, 2008).

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Fuente:

  • Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) 2008, White Spot Disease, en Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 5ed., consultado el: 14 de Septiembre de 2011, disponible en: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/2010/2.2.05_WSD.pdf
  • Pretto R 1982, Breve Descripción de la Tecnología de la Cría de Camarones Peneidos en Panamá, Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá (IDIAP).
  • Zhang J, Dong S, Tian X, Dong Y, Liu X, Yan D 2006, Studies on the rotifer (Brachionus urceus Liennaeus, 1758) as a vector in White spot síndrome virus (WSSV) transmission, Aquaculture, vol. 261, no 4, p. 1181-1185.

Control biológico y la Reproducción Asistida, Nuevas Herramientas para Conservación de Anfibios

Espécimen en exhibición en El Valle Conservation Amphibian Center (EVACC), Foto: Lizzi M. Herrera 2010

¿Conoces a la rana de la especie Atelopus zeteki? es común ver su imagen en los mercados de artesanías, ojalá fuera tan común verla en estado silvestre…  Este anfibio mejor  conocido como la rana dorada era habitual en regiones específicas de Panamá, su población ha disminuido en comparación con las observaciones realizadas en 1980. Es muy rara y casi extinta en Cerro Campana y está reportada como extinta en el Valle de Antón desde hace 40 años (Karen Lips et al, 2010).

La llegada del hongo Batrachochytridium dendrobatidis ha afectado severamente a las poblaciones de anfibios del área neotrópical de Panamá. Desde el 2004 la poblaciones de anfibios de El Copé colapsaron, desapareciendo en cuestión de meses (K. Lips et al 2010). La chytridiomycosis es una epidemia que se esta esparciendo desde el oeste al este de Panamá, las poblaciones en el este están en severo riesgo de desaparecer.

Diversas universidades en Estados Unidos están  invirtiendo tiempo y recursos en investigaciones, para controlar el hongo quítrido y en la conservación de las especies que han sido diezmadas por esta epizootia global. En este reporte quiero hacer alusión  a dos líneas de investigación, que tienen un enfoque práctico y que pudieran ser parte de la solución de este problema; que esta reduciendo de forma drástica las poblaciones de anfibios.

El primero de estos estudios se realiza en la Universidad Estatal de Oregon, en Estados Unidos, desde hace varios años han tratado de controlar y tratar la chytridiomicosis in vitro, incluyendo tratamientos con compuestos anti-fúngicos y la suplementación de microbios cutáneo (bioaugmentation).

En esta investigación, se descubrió que una especie de zooplancton es capaz de consumir al hongo responsable de la devastación en las poblaciones de anfibios en diversos puntos del planeta. El organismo en estudio es la Daphnia magna, quien tiene el potencial de ser una herramienta para el control biológico del hongo (Julia Buck et al, 2011)

En el estadio infectivo, el Batrachochytrium es una zoospora flagelada de vida libre acuática, de 3 – 5μm de diámetro. Este diámetro está dentro del intervalo de tamaño de presas preferidas de cladóceros como la Daphnia spp. La Daphnia  es abundante en ambientes lénticos a nivel mundial, son filtradores selectivos, que consumen algas nanoplactónicas, bacterias, hongos, protozoarios y dedritos de un tamaño de 1 – 100μm (Julia Buck et al, 2011).

Los experimentos in vitro demostraron que, la D. magna es capaz de consumir zoosporas de Batrachochytrium y respalda el potencial de los controles biológicos para controlar al Bd. Los resultados de este estudio deben ser evaluados en sistemas naturales para una mejor compresión de como el Batrachochytrium puede ser controlado por el zooplancton.

Daphnia magna, hembra adulta – Foto por Hajime Watanabe, Creative Commons, Public Library of Science

Otros posibles biocontroladores de Bd podrían ser otras especies de zooplancton, copepodos (Copepoda)  y larvas de camarón (Ostracoda). Basados en estas observaciones los zooplancton podrían ser reguladores ecológicos de las poblaciones de Bd, reduciendo el riesgo de infección de los anfibios en ambientes acuáticos. Los copepodos han sido modelos exitosos como control biológico en otros sistemas, por ejemplo, aplicaciones de Mesocyclops han reducido las poblaciones de larvas de mosquito, eliminando de esta forma el vector del Dengue Hemorrágico y reduciendo la incidencia de la enfermedad (D. Woodhams et al, 2011).

La segunda investigación es llevada a cabo por el Smithsonian Conservation Biology Institute (SCBI) en Washington DC; quienes han empezado a colectar muestras de esperma de la especie Atelopus zeteki,  que es parte de la colección del zoológico.

Aunque los investigadores han colectado muestras de espermas de otras especies de anfibios como la rana gopher de Misssissippi y la rana leopardo, no existe aún publicaciones que detallen la metodología de colección de esperma en la rana dorada.  Los  colegas del zoológico de Maryland han colaborado en el proceso, dando asesoramiento a los investigadores del SCBI sobre la metodología para colectar espermatozoides de la rana, utilizando estimulación hormonal.

El congelamiento del esperma, podría ser un modelo para asegurar a largo plazo la integridad genética de otras especies en situaciones similares. Gina Della Togna es una estudiantes de  PhD panameña del SCBI, está a cargo del procedimiento de colección de esperma. Aunque esto es una técnica relativamente novedosa, Della Togna expresa que siente que es comparable a la colecta de esperma de mamíferos. Después de la estimulación hormonal, los espermatozoides son excretados por la cloaca de la rana. En contraste con los mamíferos que poseen estructuras especializadas para la reproducción y desechos.

Aunque la colección de esperma de estas especies ha sido exitosa, encontrar el protocolo más eficiente, reproducible de estimulación es crítica; la identificación del criopreservante y método de congelamiento correcto puede ser otro desafío.  Los investigadores sospechan que el componente celular responsable del movimiento del esperma, llamado vesícula mitocondrial, tiene una estructura única comparada con la de otros animales.

La rana dorada tiene un gran valor cultural, fue elemento de orfebrería de las antiguas poblaciones precolombinas y hoy día es parte de la nacionalidad de todos los panameños. Todo esto son valores agregados para el trabajo que conlleva preservar el material genético de esta especie que es endémica en la región.

Información sobre: El Festival de la Rana Dorada

Como parte de los trabajos de comunicación y concientización sobre el estado actual esta especie se está realizando el Festival de la Rana Dorada del 10 – 19 de agosto, en marco de la celebración del día de la Rana Dorada el 14 de agosto. Les exhorto a participar en el foro público: “El impacto cultural y el estado de conservación de la Rana Dorada y otros anfibios de Panamá”.

Glosario:

  • Ambientes lénticos: Son cuerpos de agua cerrados que permanecen en un mismo lugar sin correr ni fluir, como lagos, las lagunas, los esteros o los pantanos. Comprenden todas las aguas interiores que no presentan corrriente continua; es decir, aguas estancadas sin ningún flujo de corriente.
  • Bioaugmentation: Es la introducción de un grupo de cepas microbianas o una variedad genéticamente modificada para tratar aguas o suelos.

Fuentes:

  • Buck JC, Truong L, Blaustein AR (2011) Predation by zooplankton on Batachochytrium dendrobatidis: Biological control of the deadly amphibian, Oregon State University.
  • Jaseph P (2012) National Zoo Successfully Collects Sperm Samples to Save Endagered Frog, Amphibian Rescue and Conservation Project, consultado el: 5 de agosto de 2012, disponible en: http://amphibianrescue.org/2012/02/09/national-zoo-successfully-collects-sperm-samples-to-save-endangered-frog/
  • Woodhams D, Bosch J, Briggs C, Cashins S, Davis L, Lauer A, Muths E, Puschendorf R, Schmidt B, Sheafor B, Voyles J (2011) Mitigating amphibian disease: strategies to maintain wild populations and control chytridiomycosis, Front Zool. 2011; 8:8. Published online 2011 April 18. dpi: 10.1186/1742-9994-8-8.

Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS)

Virión - Coronavirus/ Wiley (2007)

La inspiración para realizar esta revisión nace al observar en el Documental, “Cazadores de Virus”, los efectos del SARS. Vagamente recordaba haberla escuchado mencionar en alguna clases de microbiología. Por ello deseo compartir las generalidades y sobre todo de las características del agente causal de esta enfermedad respiratoria: el Coronavirus.

El nombre de Coronavirus hace referencia a la estructura del virión, cuyos peplómeros (13 nm) se proyectan en la envoltura viral y asemejan una corona solar. Los peplómeros juegan un importante rol la neutralización de la respuesta inmune celular. Estos virus son la segunda causa del resfriado común detrás del  rinovirus. En el 2002 se reporta un brote del síndrome respiratorio agudo grave mejor conocido como SARS en la provincia de Guangdong, en el sur de China, extendiéndose a Hong Kong y al resto del mundo. El serotipo específico que causó este brote fue el COV-SARS.

El genoma del Coronavirus esta constituido por RNA de simple cadena, sentido positivo (+), el cual esta rodeado por una envoltura que incluye una bicapa lipídica derivada del retículo endoplasmático rugoso. Los viriones miden entre 80 a 160 nm de diámetro. Las glucoproteínas de la superficie de la envoltura tienen el aspecto de proyecciones en forma de bastón que aparecen como un halo alrededor del virus. La cubierta en forma de corona formada por las glucoproteínas le permite soportar las condiciones del tubo digestivo y diseminarse por vía feco-oral.

Tiene un genoma de 33 kb, se asocia a la proteína N para formar una nucleocápside helicoidal. El genoma se traduce para producir una poliproteína que se hidroliza y origina una polimerasa de ARN dependiente de ARN. La polimerasa genera un molde de ARN de cadena negativa. A continuación, la proteína L utiliza este molde para replicar nuevos genomas y producir entre cinco y siete moléculas individuales de ARN mensajero que codifican una de las proteínas virales. La fabricación de estas moléculas individuales también podría favorecer sucesos de recombinación entre los genomas virales y, en consecuencia, la diversidad genética.

Los viriones contienen las glucoproteínas E1 y E2, así como una nucleoproteína vírica N; así mismo, algunas cepas contienen una hemaglutinina-neuraminidasa E3. Las glucoproteína constituye el objetivo de los anticuerpos neutralizantes. Las glucoproteína E1 es una proteína transmembrana .

El genoma viral del Coronavirus posee en su extremo 5' una cap metilada y en el extremo 3' una cola poliadenilada / Wiley (2007)

Los coronavirus en las vías respiratorias infectan las células epiteliales. La infección se localiza en las vías respiratorias superiores debido a que la temperatura óptima para la proliferación vírica es de 33° a 35°C . Lo más probable es que el virus se transmita a través de gotas aerolizadas y en gotas de mayor tamaño. Las infecciones tiene un periodo de incubación promedio de 3 días y puede reagudizar en un trastorno pulmonar crónico preexistente, por ejemplo el asma o la bronquitis y en ocasiones puede originar una neumonía.

La enfermedad producida por coronavirus aparece esporádicamente o en brotes durante los meses de invierno y primavera. En cada brote predomina una cepa. Los resultados de estudios serológicos han mostrado que los coronavirus provocan aproximadamente entre un 10% y 15% de las infecciones de las vías respiratorias superiores y las neumonías en el ser humano. La detección de anticuerpos frente a coronavirus es habitual en la edad adulta, aunque se suele producir reinfecciones a pesar de su presencia en el suero.

El SARS es una forma de neumonía atípica caracterizada por fiebre elevada (arriba de 38°C), escalofríos, rígidez, cefaleas, mareos, malestar general, mialgias, tos o dificultades respiratorias y antecedentes de exposición a una persona o lugar asociado a este síndrome a lo largo de los 10 días anteriores. Hasta un 20% de los pacientes presenta también diarrea. Es muy probable que el virus COV-SARS se transmita en gotículas respiratorias, también se encuentra en el sudor, la orina y las heces.

El brote de SARS del año 2002 se extendió a Hong Kong a través de un médico que había colaborado en la epidemia inicial, atendiendo a los pacientes, por lo que contrajo la enfermedad y murió. Posteriormente se extendió a Vietnam, Singapur, Toronto y Estados Unidos a través de viajeros que se hospedaron en el mismo hotel, en el cual se encontraba el doctor. La morfología vírica en el microscopio electrónico y los resultados de la RT-PCR demostró la pertenencia del virus a los coronavirus. Se cree que el virus pasó al ser humano desde un animal criado como alimento. Una alerta global de la Organización Mundial de la Salud motivó la introducción de medidas de contención para limitar la diseminación del virus y controlar el brote. Finalmente se obtuvo un total de los 8000 sujetos infectados y 800 muertos.

Fuente:

Carter J, Saunders V 2007, Virology Principles and Applications, Ed. John Wiley & Sons Ltd. England.

Murray P, Rosenthal K, Pfaüer M 2007, Microbiología Médica, 5ta Edición, Ed. Elsevier, Madrid, España.

Kenneth R, Ray GC 2004, Sherris Medical Microbiology, 4ta Edición, Ed.McGraw-Hill Companies Inc. United States.

Pseudo-nitzchia y el Ácido Domóico

Ácido Domoico

¿Podrías creer que una diatomea es capaz de desorientar pelícanos, gaviotas, leones marinos?  Las diatomeas del género Pseudo-nitzchia,

Ejemplo de la intoxicación en animales marinos

son productoras del ácido domóico, que es tóxico para la especies mencionadas. Es interesante el desarrollo de la toxicología de los fitoplancton donde se determina que ciertas especies como Gymnodinium catenatum y la Pseudo-nitzchia, generan fuertes toxinas que pueden llegar a afectar a especies superiores.

Básicamente el ácido domóico es una biotoxina marina que fue el causante de una intoxicación alimentaria en 1987 en Canadá, registrándose muertes después de la ingesta de mejillones contaminados. En humanos se observó  la amnesia anterógrada, que puede llegar a ser permanente. El hipocampo en las víctimas humanas se vio seriamente afectado, con necrosis celular en algunas áreas, así explicando el porqué puede generarse amnesia permanente.

En 1996 y en 1998 se observó altas proliferaciones de Pseudo-nitzchia spp.  asociadas con altas densidades de Skeletonema costatum y a su vez coincidieron con las intoxicaciones de mamíferos marinos en el sur de California, atribuidas a la ingesta de peces portadores de ácido domóico.

Se cree que existe dos períodos ambientales en el ciclo anual de las aguas de la región: periodo de enfriamiento (otoño – invierno) con predominio de vientos del Noroeste y el desplazamiento de masas de agua de norte a sur y el periodo de calentamiento (primavera – verano) con vientos suroeste y frentes de masas de agua norecuatoriales en ascenso, de sur a norte.

Pseudo-nitzchia

Ambos periodos manifiestan variaciones interanuales que parecen reflejarse en la composición, la densidad y el comportamiento de las comunidades del plancton. En la primavera del año 2000 se registraron muertes de mamíferos y aves marinas cerca de Acapulco. En el verano del 2001 se observó una gran mortandad de peces, delfines.

El aumento en el número de especies de Pseudo-nitzchia capaces de producir producir proliferaciones algales, es un tema de mucho interés para investigadores. Estos episodios naturales y su impacto en la salud pública y en el sector pesquero, se controlan hoy día en los países desarrollados mediante el establecimiento de programas de seguimiento de la calidad del medio y de los productos marinos dedicados al consumo humano.

Fuente:

Alvarez-Falconi P (2009) Ácido Domoico e Intoxicación Amnésica por Moluscos en Salud Pública, Rev Perú Med Exp Salud Pública, 26(4); 505-16. Perú.

Gómez – Aguirre S, Licea S, Gómez S (2004) Proliferaciones de Pseudo-nitzschia spp. (Bacillariophyceae) y otras especies de microplancton en la Bahía de Mazatlán, México, Revista de Biología Tropical v.52 supl.1 San José sep. 2004.

Vargas-Montero M, Freer E (2004) Proliferaciones algales de la diatomea toxigénica Pseudo-Nitschia (Bacillariophyceae) en el Golfo de Nicoya, Costa Rica, Rev. Biol. Trop. 52 (Suppl.1): 127-132, Costa Rica 2004.

¿Por qué la Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) no es una novedad?

Klebsiella pneumoniae - imagen de microscopía electrónica (Microbiología Médica y Parasitología)

Los casos que se observan en la Caja de Seguro Social son un vivo ejemplo del efecto de microorganismos oportunistas que generan resistencia a antibióticos. En su mayoría forman parte de la flora normal del tubo digestivo o proceden del medio externo. Se caracterizan por presentar exigencias nutricionales escasas y son relativamente resistentes a los agentes externos y a un gran número de antibióticos.

Este comportamiento en las poblaciones bacterianas no es nada nuevo, desde antes de 1998 se ha estado observando el empleo inadecuado de antibióticos donde se estima que por lo menos la mitad del uso de este tipo de medicinas en Estados Unidos es innecesarios o inadecuado. Ya sea porque no se debieron recetar, se prescribe el que no es apropiado o la dosis no es la correcta, así como tampoco el tiempo de administración.

Otro problema está en los productos caseros de limpieza, como jabones, crema dental que generan una selección natural donde  sobreviven las bacterias más fuertes y que son capaces de generar resistencia a fármacos y a productos bactericidas. Todo estos factores nos llevan a este punto donde experimentamos un resurgimiento de bacterias cada vez más fuertes a los medicamentos. Por lo menos dos decenas de tipos de bacterias han desarrollado una resistencia total a uno o más antibióticos.

Los archivos de los hospitales dan un indicio sobre la magnitud del problema. A pesar de que no existen cifras sobre el número de pacientes que ingresan a un hospital ya infectados, sólo en Estados Unidos para 1998 más de dos millones de personas caen presas de los microbios una vez que se encuentran en él. Alrededor de 90,000 mueren. Cerca del 70 por ciento cae bajo el ataque de bacterias que son resistentes a los fármacos . El coste incurrido en el tratamiento de estas infecciones se aproxima a los 5000 millones de dólares al año.

Es conocido que las bacterias oportunistas forman parte de la flora hospitalaria y son capaces de sobrevivir en medios mínimos y aun colonizar la piel y mucosas de los enfermos hospitalizados. Su acción patógena es escasa, pero puede manifestarse cuando se produce un aumento de susceptibilidad del huésped, debido a una inhibición o disminución de sus mecanismos defensivos.

En este caso la Klebsiella es una enterobacteria inmóvil, en su gran mayoría productora de ureasa, que se caracteriza por la   presencia de una cápsula y la formación de colonias mucosas en medio sólido. Presentan un antígeno capsular K y un antígeno somático O, que por pruebas de aglutinación o de hinchamiento de la cápsula ha permitido dividir el género en 11 grupos O y 80 tipos K, algunos de los cuales presentan reacciones cruzadas con los polisacáridos capsulares del neumococo. Algunas cepas presentan fimbrias y además se ha demostrado la producción de bacteriocinas (klebocinas).

La Klebsiella pneumoniae se encuentra en las vías respiratorias superiores del 5 – 10% de las personas normales y se aislan del 20% de esputos  y también de las heces, por lo que su hallazgo no es significativo. Interviene en procesos neumónicos, que, a diferencia de la neumonía neumocócica, se caracterizan por presentar una clara tendencia a la necrosis de los espacios alveolares con formación de abscesos y elevada mortalidad, especialmente en alcohólicos y enfermos hospitalizados.

Colonias de Klebsiella pneumoniae

Algunas formas en la que se puede identificar a las bacterias del género Klebsiella son:

  • En el agar MacConkey K. pneumoniae forma colonias de bode entero de color rosado a rosado oscuro de 3 – 4 mm de diámetro y aspecto mucoide.
  • En pruebas bioquímicas se evalúa las siguientes ensayos con su respectivo porcentaje de reacciones positivas:
    • Indol – 0%
    • Rojo Metilo – 10%
    • Voges Proskauer – 98%
    • Citrato (Simmons) – 98%
    • Hidrógeno sulfurado (TSI) – 0%
    • Hidrólisis de urea – 95%
    • Lisina descarboxilasa – 98%
    • Arginina descarboxilasa – 0%
    • Ornitina descarboxilasa – 0%
    • Motilidad – 0%
    • Hidrólisis de gelatina – 0%
    • Ácidez D-glucosa – 97%
    • Gas D-glucosa
    • Lactosa (fermentación) – 98%
    • ONPG – 99%

Haciendo un análisis de toda la información que ha surgido sobre la presencia de esta bacteria dentro de las instalaciones del Complejo Metropolitano Arnulfo Arias Madrid (CSS); he concluido que esta situación desde el principio fue mal manejada, pienso que el personal que manipuló la información de la presencia de este brote bacteriano, no debió desestimar la alerta. A veces estas omisiones y el poco importa de algunos de los profesionales de la salud en nuestro país generan las crisis, que últimamente golpea al sistema de salud más seguido, ¿es tan difícil tener presente que se trabaja con vidas humanas? Las investigaciones más que centrarse en pedir destituciones de directores deben centrarse en investigar donde estuvo el fallo inicial en el personal que directamente lidia con los pacientes, en el personal que debió informar, en el personal que debió actuar y ejercer el cargo por el que fue nombrado.

Fuente:

Pumarola A, Rodríguez A, García – Rodríguez JA, Piédrola – Angulo G, Microbiología y Parasitología Médica, 2da Ed., Ed. Salvat Madrid.

Radetsky P (1998) Los Últimos Avances de la Medicina Maravillosa, Revista Discover.

Sacsaquispe Contreras R,  Ventura Egúsquiza G, (2005) Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Lima Perú.

El Caso de María Tifoidea

Reseña sobre María Tifoidea

María Tifoidea (Mary Typhoid) se ha convertido en un clásico ejemplo sobre la condición de un portador crónico. Los hechos se dieron a comienzos del siglo XX, en Long Island en la cuidad de Nueva York dónde María fungía como cocinera en varias casas de huéspedes e instituciones convirtiéndose en un foco de infección a un gran número de personas.

El gran número de brotes de fiebre tifoidea generan una investigación extensiva por parte del Dr. George Soper, donde se determinó que la posible  fuente de contaminación era María.  Entonces se procede a realizar un análisis bacteriológico de su heces y en efecto presentaron un elevado número de la bacteria Salmonella typhi, el agente causal de la fiebre tifoidea.

La raíz de la condición de portadora crónica en María radicaba en el hecho de que probablemente su vesícula biliar estaba infectada y los microorganismos se excretaban continuamente desde allí al intestino.

Ante esta situación la autoridades sanitarias le ofrecieron extirpar la vesícula biliar, pero María rechazó la operación y para evitar que siguiera siendo una fuente de contaminación fue llevada a prisión, donde estuvo alrededor de 3 años recluida fue liberada bajo el compromiso de que no volvería a cocinar ni a manipular alimentos para otras personas y que se reportaría a las autoridades sanitarias cada tres meses.

María lastimosamente desapareció rápidamente y cambió su nombre y volvió a ser cocinera en hoteles, restaurantes y sanatorios dejando un evidente rastro de fiebre tifoidea. A los cinco años fue capturada nuevamente por las investigaciones realizadas por la nueva epidemia que se dio en un Hospital de Nueva York. Nuevamente María es arrestada y conducida a prisión, donde permaneció bajo custodia en la Isla de North Brother en el río East de la ciudad de Nueva York.

Fuente:

Madrigan MT, Martinko JM, Parker J (2004) Biología de los Microorganismos, 10ma Edición, Southern Illinois, University Carbondale: Ed. Pearson Prentice Hall