La Nanomedicina y el cáncer

Nanoparticulas

Nanopartículas en la detección de cáncer

El concepto de nanomedicina puede ser descrito como el uso de materiales entre 1 a 100 nanómetros, aplicados a la salud y medicina. La nanomedicina es un método novedoso para el tratamiento del cáncer, ante las limitantes en los tratamientos actuales como: la baja especificidad de los fármacos a las células tumorales, baja biodisponibilidad  y biodegradación de los mismos.

El interés principal que se adjudica a la nanotecnología es el de mejorar los métodos diagnósticos actuales y el desarrollar mejores sistemas de administración de medicamentos para obtener terapias mas eficaces contra enfermedades como el cáncer. Uno de los mas importantes problemas que tiene la medicina actualmente es que no se conoce un método efectivo para la aplicación de medicamentos u otros agentes terapéuticos en el lugar exacto que lo necesite el cuerpo del paciente.   

Actualmente existen muchas limitaciones en el estudio del Cáncer debido a la complejidad que presenta esta enfermedad. Actualmente, se considera como tratamiento “efectivo” la quimioterapia, la radioterapia y cirugía.

Los tratamientos que se brindan en centros oncológicos son muy invasivos y la nanotecnología brinda la posibilidad de tratamientos menos agresivos, específicos al tejido canceroso específico, utilizando bajas dosis del fármaco, obteniendo una disminución en los efectos secundarios y optimizando los resultados esperados.

El principal reto que presenta el cáncer es la metástasis, que dificulta el control de tumores cancerosos. La Nanotecnología  tiene soluciones para controlar la metástasis, monitoreando sensores genéticos y proteínicos, aplicados in vivo. Otra Gran dificultad para los estudios en cáncer es que la metástasis se produce antes de que se detecte.

Prototipos de nanopartículas contra el cáncer

Estas unidades son más grandes que los átomos y las moléculas. No obedecen a la química cuántica, ni a las leyes de la física clásica, presentando características propias. Se sitúan a corto plazo como una de las aplicaciones más inmediatas de la nanotecnología con productos y sectores que ya están presentes en el mercado.

Las nanopartículas están avanzando con descubrimientos casi diarios en muchos frentes. Obviamente estamos refiriéndonos a las nanopartículas creadas artificialmente a través de la ingeniería de partículas en los laboratorios, creadas a nanoescala por investigadores.

Las Nanopartículas forman parte de la nanotecnología avanzada que consta de la fabricación molecular con las especificaciones del área en el que se empleará. Entre las Nanopartículas que se perfila, utilizar en tratamientos contra el cáncer tenemos:

  • Quantum dots, son nanopartículas hechas de semiconductores que tengan propiedades singulares ópticas y eléctricas magnéticas (Jiang et al. 2004; Jain, 2005; Chan, 2006).
  • Los Dendrimers  se tratan de una nanopartícula  tridimensional ramificada, puede servir como buen agente de entrega del tratamiento. Es normalmente utilizado en la evolución terapéutica que se orienta a las células cancerosas. . (Ha et al., 2005; Jain, 2005).
  • Nanoshells son nanopartículas hechas de sílice completamente cubiertas de oro, su diámetro puede variar de 100nm a varios cientos de nanómetros, los investigadores están tratando de hacer uso de nanoesferas de oro para la detección y tratamiento de células cancerosas. . (Ha et al., 2005; Jain, 2005).

También entre otras nanopartículas cabe mencionar: partículas poliméricas, partículas magnéticas, nanotubes (estas nanopartículas mencionada son mas prácticas para el tratamiento del cáncer que otras). Todas estas partículas forman la materia prima para desarrollar los tratamientos contra el cáncer.

Nanopartículas contra el cáncer de próstata

La orientación de los estudios en Nanopartículas para tratar el cáncer de próstata (Langer y Farhrokzad et al.), ha mostrado buenos resultados en efectos de la unión de oligonucleótidos (peptídicos o ácidos a moléculas específicas), en las células cancerosas  y disminución de la masa tumoral.

Estos oligonucleótidos de ADN o ARN con la capacidad de unión a antígenos son mejor conocidos como “aptamers”.

Los aptamers presentan las siguientes características: no son muy grandes (no afectan la molécula en su globalidad), no presentan inmunogenidad, tienen una gran estabilidad, gran afinidad y especificad. Estas características son muy importantes en la acción de la droga.

Un punto muy importante en este estudio fue la disminución de efectos secundarios en células sanas. En el estudio se empleó modelos animales, los cuales fueron inducidos y se evaluaron durante 21 días bajo diversas condiciones, la masa del tumor se evalúo durante 109 días.

También estos estudios trataron los problemas del cese de circulación por el sistema reticuloendotelial con el poli(óxido de etileno) modificado con poli(beta aminoácidos ester), (Amiji y Langer et al). Por este medio se aplicaron estas dos nanopartículas a los ratones observando su eficacia para mantener la circulación.

Nanopartículas contra el cáncer de mama

En otra investigación realizada por Kommareddy y Amiji donde trabajaron con las Nanopartículas Poli(etilenglicol)- modificados con gelatina tiolada. Para tratar el cáncer de mama mediante Nanopartículas que entregan genes terapéuticos.

Igualmente se trabajaron con ratones donde se demostró que estas nanopartículas trabajan como vectores y son un  medio seguro de entrega de genes para inhibir el crecimiento del tumor sólido, estas nanopartículas se inyectan directamente por el torrente sanguíneo y actúa directamente en el tumor donde se encuentra la proteína sFlt, esta proteína forma parte de los receptores solubles del tumor auxiliándose por un factor angiogénico quien corta el suministro de sangre al tumor conllevando a su destrucción.

En esta investigación se decidió trabajar con gelatina para la colección de nanopartículas para mayor seguridad contra el rechazo en el cuerpo humano.La gelatina tiolada se modificó para que reaccionara con metoxi – poli (etilenglicol)- succinimidil glutarato para prolongar la permanencia en el cuerpo in vivo. Esta técnica presentó mayor captación y retención de nanopartículas posteriores a su administración.

Detección temprana del cáncer

Otra  aplicación de gran importancia en el cáncer es el uso de Nanopartículas para la detección temprana del cáncer, en el artículo “Dual-modality Microbeads Identify Disease Biomarkers”  (Tuschar Sathe, 2007), se basa en una técnica  donde se añaden nanopartículas ópticas y magnéticas. Que permite el uso de un campo magnético donde las nanopartículas se desplazan entre los poros de micro cuentas.
La adición de nanopartículas magnéticas permite el uso de un campo magnético para atraer o eliminar cuentas.

Tomando  este procedimiento Sathe, introduce fluorescentes puntos cuánticos y nanopartículas de óxido de hierro magnético. Se sintetizan los puntos cuánticos de diferentes colores y diferentes tamaños dándole una particularidad óptica permitiendo a los investigadores detectar moléculas de varios destinatarios.

En diagnósticos mediante la orina o sangre se identifican ciertas moléculas presentes que indican la presencia de ciertas enfermedades.

Cómo ya se pudo observar la Nanotecnología ha traído nuevos conocimientos en el área tanto diagnostica con marcadores de células cancerosas como terapeuta atacando los tumores cancerosos, siendo mucho mas eficiente respecto a otros métodos que combaten el cáncer.

Referencias:

Sathe TR, Agrawal A, Nie S. Mesoporous Silica Beads Embedded  with Semiconductor Quantum Dots and Iron Oxide Nanocrystals: Dual-Function Microcarriers for Optical Encoding and Magnetic Separation. Anal. Chemistry. 2006; 78: 5627- 5632.

Kommareddy S, Amiji M. Biodistribution and Pharmacokinetic Analysis of Long-Circulation Thiolated Gelatin Nanoparticles Following Systemic Administration in Breast Cancer-Bearing Mice. J Pharm Sci; in press.

Farokhzad OC, Karp JM, Langer R. Nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer targeting. Expert Opin. Drug Deliv. 2006; 3: 311-324

Beeta Ehdaie, Department of Biomedical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia, Charlottesville,VA 22904, USA, Application of Nanotechnology in Cancer Research: Review of Progress in the National Cancer Institute’s Alliance for Nanotechnology

Gregory J. Downing, Director, Office of Technology and Industrial Relations National Cancer Institute, Nanotechnology Characterization Laboratory: Supporting Medical Product Development for Cancer Applications National Toxicology Program Board of Scientific Advisors March 15, 2006

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Conceptos Básicos en Cultivo Celular – Equipos de Laboratorio

Cámara de flujo laminar para cultivo celular

Al momento de iniciar las prácticas profesionales, muchos estudiantes sienten algo de ansiedad a la hora de trabajar en el área de cultivo celular dada la gran probabilidad a contaminar las preciadas muestras por la falta de experiencia.

Casi siempre al investigar la fuente de la contaminación llegamos a la conclusión que algún detalle en la manipulación del operario fue la fuente primaria de la presencia de hongos y bacterias en los cultivos. Idealmente el trabajo debe ser llevado en una locación que debe estar separado en áreas de:

  • Material limpio (libre de contaminantes)
  • Material sucio (área de cuarentena, muestras).

De no ser posible el material debe ser separado por periodos de manipulación o trabajo, dónde el material limpio debe ser utilizado previamente a manipular el material sucio (muestras). Diferentes incubadoras deben ser designadas de acuerdo al tipo de cultivo que se mantiene en ellas. También las superficies de trabajo deben ser limpiadas rigurosamente entre actividades. Todo material nuevo debe ser manejado como material de cuarentena hasta que se demuestre que esta libre de contaminantes como bacterias, hongos y particularmente micoplasmas.

Llevar un cultivo de células en áreas comunes, requiere de una planeación y es esencial que se usen buenas prácticas para minimizar el riesgo de contaminación de su trabajo. La mayoría de las líneas celulares de laboratorio deben ser manipuladas en un nivel de contención nivel dos. Aunque la categoría requerida es dependiente de la línea celular y la naturaleza del trabajo que se va a realizar. Además se recomienda que los laboratorios tengan presión de aire negativo en los corredores para contener cualquier riesgo de contaminación cruzada entre laboratorios.

La cámara de flujo laminar es probablemente el equipo más importante, ya que operado de forma correcta, asegura un ambiente limpio de trabajo para los insumos, cultivos y al mismo tiempo protege al operador de los aerosoles. En estas cabinas, la protección al producto y/o operador es dado a través de los filtros HEPA (high efficiency particulate air). Los ductos de la cabina circula hacia la atmósfera o re-circula a un segundo filtro HEPA, antes de ser liberado a la atmósfera.

Se debe realizar monitoreos con agar triptona de soya y colocar los platos dentro de las cabinas por un mínimo de 4 horas, lo cual debe ser buen indicador de que tan limpias se encuentran las cabinas. No se debe reportar crecimiento de bacterias o hongos en dichos platos. En la mayoría de los casos las cabinas de clase II son adecuadas para el cultivo de células. Aunque, cada estudio debe ser evaluado los factores de riesgo probable en cada elemento adicional, como posible infección viral de fuente desconocida, podría requerir mayores niveles de contención.

Laboratorio de Cultivo Celular

Laboratorio de Cultivo Celular

Otros equipos que son relevantes en instalaciones de cultivo celular son:

  • Centrífugas: Este equipo es utilizado rutinariamente en el cultivo de células como parte de los procedimientos de sub-cultivo para la mayoría de las líneas celulares y para la preparación de la criopreservación de las células. Por su naturaleza, las centrífugas producen aerosoles y por ello, es necesario minimizar cualquier posibilidad de riesgo de exposición. Las centrífugas deben ser de tapas transparentes para que en caso de algún derrame, pueda ser ser detectado sin abrir la tapa. Esto reducirá el riesgo del operador a ser expuesto a material peligroso si la centrífuga presenta algún incidente durante el proceso. Se debe cuidar siempre de no sobre llenar los tubos y realizar el apropiado balance. Estos pasos podrán reducir el riesgo de generar aerosoles. Las centrífugas deben ser colocadas en un sitio de fácil acceso para la limpieza, mantenimiento y ser evaluadas frecuentemente para detectar signos de corrosión.
  • Incubadoras: Estos equipos son utilizados de rutina para proveer las condiciones apropiadas para el crecimiento de las células, como la temperatura, humedad y niveles de CO2 de manera controlada y estable. Generalmente deben programarse a temperaturas en un rango de 28°C (para líneas celulares de insecto) hasta 37°C (para líneas celulares de mamíferos). Algunas incubadoras tienen la facilidad para controla los niveles de oxígeno, la inclusión de tratamientos para las bandejas de baño maría en la incubadora, reducirán el riesgo de crecimiento de bacterias y hongos en las bandejas de agua. Aunque no hay sustituto a la limpieza frecuenta de la incubadora.

Fuentes:

  1. Sigma Life Science (2012) Cell Culture Manual 2011-2014, Technical Information, SIGMA-ALDRICH, 308-309.
  2. Basant Kumar Sinha, Rinesh Kumar (2008)Principles of Animal Cell Culture, 65-68,International Book Distributing Co.

Hidrocarburos poliaromáticos y sus efectos tóxicos

HPA - hidrocarburo poliaromatico

Moléculas de HPA

La contaminación del medio ambiente, se ha incrementado con la gran actividad industrial que se ha desarrollado en el último siglo. Estos contaminantes interactúan con el medio ambiente y hacen que los seres vivos de alguna manera la incorporen a su propio organismo causando diversas afecciones.

Los hidrocarburos poliaromáticos se encuentran dentro de los compuestos químicos más peligrosos y tóxicos que se emiten al medio ambiente junto a los metales pesados, los organoclorados y los radionulcleidos.

La referencia histórica más antigua sobre estos compuestos se remonta a 1775, con Percival Pott, quien fue el primero en asociar la exposición al hollín de las chimeneas con el cáncer de escroto de los deshollinadores. Seguramente Pott no supo qué tipo de moléculas intervenían en el proceso de la carcinogénesis, pero su observación fue trascendente y abrió el camino para investigar el cáncer de origen químico.

Los Hidrocarburos Poliaromáticos

Los HPA se generan mediante el proceso de pirólisis o pirosíntesis, que consiste en la combustión incompleta de la materia orgánica. Están formados por la fusión de dos o más anillos aromáticos, con seis átomos de carbono cada uno y que al unirse comparten dos átomos de carbono. Se conocen alrededor de 100 grupos de HPA.

Características y Propiedades Físicas

Los HPA son considerados compuestos orgánicos persistentes (COP), debido a que pueden demorar semanas, meses o años en degradarse. Los de menor peso molecular tienden a absorberse rápidamente y con facilidad se volatilizan. Son insolubles en agua, solamente son solubles en solventes orgánicos como tolueno, acetona, metanol, ciclohexano, tetrahidrofurano. Son liposolubles, por lo que se absorben fácilmente por la piel y penetran al organismo, sobre todo, en fase particulada. La vía inhalatoria también tiene un papel muy importante en la absorción de los HPA.

Su estado físico va a depender del tipo de HPA, donde se toman en cuenta el peso molecular y la presión de vapor que tenga el compuesto; y la temperatura del ambiente donde se encuentra.

Los HPA de menor peso molecular se encuentran generalmente en estado de vapor o gaseoso y los de mayor peso molecular en estado sólido o particulado. Sin embargo, cuando se tiene un HPA de menor peso molecular, a una temperatura de frío extremo, éste puede encontrarse en estado particulado, y un HPA de 5 anillos aromáticos, al encontrarse en un ambiente con clima caluroso lo podemos encontrar tanto en estado de vapor como en estado particulado.

En cuanto a la presión de vapor, cuando un HPA tiene una alta presión de vapor de aproximadamente 1 x 10-5 kPa, éste se encuentra en estado gaseoso, pero si su presión de vapor es baja, de un valor menor a 1 x 10-8 kPa, entonces lo encontramos en estado particulado.

Sin embargo, cuando la presión de vapor del compuesto está dentro de estos dos valores, entonces se puede encontrar tanto en estado gaseoso como particulado.

Fase

Compuesto

 

Presión de vapor,

kPa a 25 °C

PMa

Gaseosa Naftaleno (10-1 a 10-2) 128
Fluoreno (10-3 a 10-4) 166.2
Fenantreno (10-3 a 10-5) 178.2
Antraceno (10-4 a 10-5) 178.2
Gaseosa y

Sólida

Pirene (10-5 a 10-7) 202.3
Benz(a)antraceno (10-7 a 10-8) 228.3
Benzo(a)pireno (10-9 a 10-10) 252.3
Sólida Benzo(e)pireno (10-9 a 10-10) 252.3 (Partículas)
Sólida Benzo(g,h,i)perileno (10-10– 10-11) 276.3

Clasificación química

Los HPA pertenecen al grupo de los compuestos poliaromáticos (CPA), los cuales se clasifican en homocíclicos, si el anillo está formado solamente de átomos de carbono y, heterocíclicos, si en su anillo, además de átomos de carbono, hay uno o más heteroátomos como nitrógeno, oxígeno o azufre.

 Clasificación Química de los Compuestos Poliaromáticos

Grupo Ejemplos
CPA Homocíclicos Benzo(a)pireno

Fenantreno

Pireno

Criseno

Benzo(a)antraceno

Substituidos 1,4-Dimetilfenantreno

1-Hidroxipireno

Carbozol

 

Heterocíclicos Dibenzodioxinas

Dibenzofuranos

Interacción de HPA con el Ambiente

Los HPA pueden ingresar a las aguas superficiales a través de la atmósfera, de descargas y vertidos directos o como consecuencia de suelos contaminados que al deslizarse con las lluvias llegan a estas aguas. Los compuestos de mayor persistencia se acumulan en plantas, peces e invertebrados terrestres y acuáticos. Los mamíferos pueden absorber los HPA por inhalación, contacto dérmico o, en menor frecuencia, por ingestión. Las plantas pueden absorberlos a través de las raíces en suelos contaminados.

¿Cómo entran al medio ambiente?

Los HPA pueden encontrase en el aire como producto de emisiones al aire de los volcanes, incendios forestales,  quema de madera en los hogares, gases de los tubos de escape de automóviles, cocción de alimentos, quema de basura. En aguas de superficie por medio de las descargas de las plantas industriales y descargas de plantas de tratamiento de aguas residuales en suelos destinados a ser sitios de desechos peligrosos, cuando los envases no están debidamente sellados y suelen regarse, contaminando el suelo, por la evaporación a la atmósfera de aguas superficiales contaminadas cuyos HPA presentes luego caen al suelo o cuando se adhieren a partículas como piedras o rocas, que se depositan en el fondo de ríos o lagos, contaminando el suelo. La degradación de HPA causada principalmente por microorganismos puede durar semanas o meses, y cuya lentitud provoca acumulación de estos compuestos en plantas, peces y animales invertebrados acuáticos y terrestres, afectando la cadena alimentaria.

Química Atmosférica

Los HPA pueden reaccionar en la atmósfera, de manera química y fotoquímica, con oxígeno, ozono, radicales oxhidrilo, óxidos de nitrógeno, ácido nítrico, óxidos de azufre y ácido sulfúrico, y producir nuevos compuestos que pueden ser más tóxicos que los originales, entre ellos, carcinógenos potentes.

En general, la descomposición de los HPA está determinada por el tipo de agente químico al que están expuestos, la naturaleza del sustrato en el cual han sido adsorbidos, la temperatura, la luz y la humedad relativa.

Oxidación: Esta puede “activar” a los HPA, es decir, producir compuestos epóxicos similares a los que se producen in vivo mediante la activación metabólica.

 Nitración: Las reacciones de los HPA con los óxidos de nitrógeno y el ácido nítrico forman aza-arenos, muchos de los cuales son mutagénicos. La unión se realiza a través de enlaces covalentes de los metabolitos electrofilicos, altamente reactivos, con los sitios nucleofílicos del ADN.

Precisamente, los HPA que han sido activados por las reacciones de nitración u oxidación en la atmófera se consideran como “iniciadores” potenciales del proceso cancerígeno. Esto mismo sucede in vivo, cuando los HPA son biotransformados y convertidos en productos inductores de mutaciones genéticas.

Sulfación: Se ha reportado que los derivados de azufre de criseno, benzo[c]criseno y dibenz[aJ]antraceno en que un átomo de azufre ha sustituido a un carbono (S-análogos) son carcinógenos aún más potentes que los HPA originales.

Otras reacciones: Otros peróxidos también han demostrado capacidad para oxidar a los HPA y generar diferentes productos de oxidación.

Fuentes de exposición

En la actualidad, se sabe que los HPA son producidos por fuentes naturales, como los volcanes y los incendios forestales, así como por fuentes antropogénicas entre las que destacan: plantas coquizadoras, industria del aluminio, procesos siderúrgicos, refinación del petróleo, minas de carbón, fábricas productoras de electrodos de grafito, limpieza de chimeneas, combustión incompleta del diesel, humo del tabaco, y los procesos de ahumado y asado de la carne.

Poblaciones en riesgo

Tomando en cuenta las fuentes de exposición antes mencionadas, es evidente que las poblaciones en riesgo son prácticamente todas las de las zonas urbanas e industriales, aunque sus riesgos sean variables, dependiendo de diversos factores. Sin embargo, los trabajadores de las diversas industrias que reducen, utilizan o generan HPA son los que se encuentran en mayor riesgo.

Para poder establecer cualquier tipo de planes o programas de prevención y control en higiene ocupacional, es necesario conocer cuáles son los grupos e mayor riesgo ocupacional y describir el tipo de industrias donde laboran. En el caso de los HPA, las principales industrias relacionadas con la exposición directa a los HPA son:

 

      Plantas productoras de coque       Industria del asfalto
      Plantas productoras de aluminio       Plantas productoras de electrodos de grafito
      Plantas siderúrgicas       Plantas productoras de gas de carbón
      Refinerías de petróleo       Limpieza de chimeneas e incineradores
      Minas de carbón       Otras industrias

Distribución y excreción

Se distribuyen ampliamente en todo el organismo tras la administración por cualquier vía.

  • HPA pueden entrar a todos los tejidos del cuerpo que contienen lípidos.
  • Tienden a almacenarse principalmente en los RIÑONES, el HÍGADO y la GRASA.
  • En el bazo, las glándulas suprarrenales y los ovarios se acumulan cantidades más pequeñas.
  • Los metabolitos y sus conjugados se excretan en la orina y las heces ,pero los no conjugados que se excretan en la bilis pueden hidrolizarse por la acción de las enzimas de la flora intestinal y reabsorberse.

Efectos adversos

Los principales impactos de los HPA en la salud humana se centran en sus propiedades genotóxicas, es decir, causan daños al material genético (teratogénicas, mutagénicas y carcinogénicas). Los más potentes carcinógenos son el benzo(a)antraceno, benzo(a)pireno y el dibenz(ah)antraceno.

En rigor, los HPA son carcinogénicos sólo después de su transformación bioquímica. En efecto, durante el proceso de desintoxicación de sustancias lipofílicas, los organismos se biotransforman para dar compuestos hidrosolubles y polares cuya excreción urinaria es más fácil pero, al mismo tiempo, producen compuestos que pueden actuar como iniciadores de efectos genotóxicos, pues pueden alterar el ADN.

Industrias en cuyos trabajadores se ha demostrado exceso en algunos tipos de cáncer.

Cáncer pulmonar

Plantas productoras de coque

Industria del aluminio

Industria del gas de carbón

Industria siderúrgica

Limpieza de chimeneas

 

Cáncer del tracto gastrointestinal

Plantas productoras de coque

Industria del aluminio

Industria siderúrgica

Minas de carbón

 

Cáncer de la piel

Industria del aluminio

Industria del asfalto

Limpieza de chimeneas

 

Leucemia

Industria del aluminio

Industria siderúrgica

Industria del asfalto

 

Cáncer del sistema genitourinario

Plantas productoras de coque

Industria del aluminio

Industria del asfalto

Otros efectos de los HPA sobre la salud

Altas exposiciones a estos componentes pueden afectar: sistema respiratorio, ojos, sistema inmune. Al afectar este último sistema aumenta susceptibilidad a infecciones y enfermedades. Estas están vinculadas a tuberculosis, infección respiratoria aguda, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, ceguera y anemia.

Referencias:

Harvey, R. G. (1991). Polycyclic aromatic hydrocarbons: chemistry and carcinogenicity. CUP Archive.

McQueen, C. (2017). Comprehensive toxicology. Elsevier.

 

Identificación Bioquímica de Salmonella spp.

Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium

La identificación de Salmonella spp., es de gran importancia en la industria alimentaria (desde la planta de producción hasta la planta de procesamiento), para reducir la probabilidad de contaminación en alimentos, especialmente cuya fuente sea avícola.

Para la identificación de una bacteria es requerida la aplicación de pruebas bioquímicas, especialmente las pruebas que involucran el metabolismo bacteriano, dónde las enzimas características de cada cepa revelen la identidad de la bacteria a describir.

La identificación bioquímica de una bacteria se conoce como batería bioquímica, dónde se emplea una serie de tubos con medios especiales en los que se va evaluar el metabolismo de la bacterias y las enzimas presentes y ausentes.

El primer paso comienza al lograr aislar las colonias sospechosas de ser de Salmonella spp., éstas deben ser transferidas con un asa bacteriológica en punta estéril a una serie de pruebas bacteriológicas, con los medios de TSI (Triple sugar iron) y LIA (Lysine-iron agar)

El medio TSI, contiene: peptona, agar, lactosa, sucrosa, cloruro de sodio, extracto de carne, extracto de levadura, glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol. Su uso principal es para la diferenciación de miembros de Enterobacteriaceae basado en la fermentación de la lactosa, sucrosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico.

Para la preparación de LIA, se requiere de: agar, L-lisina, digesto pancreático de gelatina, extracto de levadura, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y púrpura de bromocresol, a un pH final entre 6.7 ± 0.2. Su aplicación es para el cultivo y diferenciación de los miembros de Enterobacteriaceae basado en su habilidad de descarboxilar lisina y formas ácido sulfhídrico. Las bacterias que descarboxilan lisina tornan el medio en púrpura y las bacterias que producen ácido sulfhídrico se muestran como colonias negras.

En cada prueba se debe deslizar el asa bacteriológica de forma estríada en la superficie del agar y luego introducir la punta del asa en los medios evaluados. Es importante señalar que el pase de las colonias debe realizarse a partir de una colonia bien aislada, dado que LIA y TSI, son empleadas para seleccionar bioquímicamente colonias sospechosas de Salmonella spp. Si se introduce un cultivo mixto en éstos medios, los resultados pueden ser inespecíficos.

Si las colonias sospechosas son encontradas solo es áreas cargadas de colonias mixtas  en el agar,  es prudente re-sembrar las colonias sospechosas, con el fin de obtener un cultivo puro previo a la inoculación de éstas colonias en TSI y LIA. Estos medio diferenciales deben ser evaluados después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Salmonella en TSI and LIA

Salmonella en TSI and LIA

Es particularmente importante con TSI, ya que una inclinación ácida a las 24 horas a menudo vuelve a ser alcalina con una incubación más prolongada, debido a los componentes proteicos del medio que usan después del agotamiento de los carbohidratos. Las observaciones con respecto al gas y al ácido sulfhídrico son útiles y se debe concentrar la atención en las reacciones al extremo y en la inclinación de los cultivos, independientemente si se manifiesta el ácido sulfhídrico o la producción de gas.

También debemos tener que en cuenta que las muestras de laboratorio que se envían pueden contener varios patógenos entéricos, no solo Salmonella y se pueden agregar agares selectivos/diferenciales para colectar más información para su identificación. Otros medios que se pueden utilizar además de LIA y TSI son:

  • Medio de Indol y Ornitina de motilidad (MIO)
  • Agar de Urea de Christensen
  • Citrato de Simmon
  • Motilidad de ornitina

En un aislado de Salmonella, se espera que en sus pruebas bioquímicas, esta descarboxile la lisina en LIA, fermente la glucosa anaeróbicamente en agar TSI, produzcan ácido sulfhídrico en agar TSI y en LIA. En las pruebas complementarias se espera que utilice el citrato, que tenga incapacidad para hidrolizar urea, producir indol a partir de triptófano.

Las reacciones de azúcar, comprenden la fermentación de glucosa manitol, maltosa y dulcitol y la incapacidad de fermentar lactosa, sacarosa y salicina. Estas reacciones bioquímicas se pueden llevar a cabo convenientemente en los medios compuestos para la identificación bacteriana, como el agar Kohn o  TSI.

Los cultivos que dan las reacciones bioquímicas características de las especies de Salmonella se prueban con los sueros O y H apropiados hasta que se identifican el grupo y el serotipo. Las pruebas bioquímicas para la identificación de salmonellas se pueden combinar para formar una prueba de identificación. Algunos de estos, como los sistemas API 20E o Enterotube II, están actualmente disponibles para su compra.

 

Fuente:

  1. Yousef, Ahmed Elmeleigy. (2003). Food microbiology : a laboratory manual. Hoboken, N.J. :John Wiley & Sons.
  2. Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. In Poultry Diseases (Sixth Edition) (pp. 110-145).
  3. García, M., & Silva, M. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Identificación bioquímica y tipado microbiológico. Unidad didáctica55, 346.
  4. Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2013). Handbook of media for clinical and public health microbiology. CRC Press.
  5. Atlas, R. M. (2006). The handbook of microbiological media for the examination of food. CRC Press.

Los Postulados de Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch

Robert Koch fue uno de los más importantes bacteriólogos de todos los tiempos, trabajó como médico rural, donde comenzó su carrera científica como bacteriólogo. Su primera contribución a la microbiología fue el aislamiento de Bacillus anthracis, agente etiológico del carbunco bacteriano, a raíz de sus investigaciones sobre el Carbunco Koch enunció una serie de leyes, los Postulados de Koch, que constituyen su mayor contribución a la historia de la Microbiología.

Estos postulados se han tomado describe la etiología de todos los agentes causantes de una enfermedad infecciosa, aunque fueron utilizados originalmente para describir al Carbunco bacteriano, una enfermedad que se transmitía de forma frecuente al hombre desde el ganado lanar y vacuno. En sus investigaciones, Koch descubrió que el patógeno se encontraba siempre en la sangre de los animales enfermos, por lo que tomó pequeñas muestras de sangre de estos animales y se las inoculó a animales sanos. El resultado fue la transmisión de la enfermedad.

En una segunda fase de investigación, Koch descubrió que el patógeno podía ser aislado de los individuos enfermos, cultivándolo en el laboratorio sin perder su capacidad patogénica, ya que cuando se les inoculaba a nuevos individuos se reproducía la enfermedad. A partir de estas investigaciones propuso los siguientes postulados:

  • El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad y ausente en los sanos.
  • El agente no debe aparecer en otras enfermedades.
  • El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad
  • El agente ha de provocar la enfermedad en un animal susceptible de ser inoculado.
  • El agente ha de ser aislado de nuevo en las lesiones de los animales en experimentación.

Estos postulados describían la etiología de la tuberculosis, del cual consiguió aislar el Mycobacterium tuberculosis. Un año después aisló el Vibrio cholerae, agente etiológico de la Cólera.

Postulados de Koch

Postulados de Koch 

De este modo se establecía un protocolo para discernir entre las muchas bacterias o agente biológicos presentes en cualquier tejido de cualquier animal. Mientras que muchas bacterias aparecen como parásitos de lesiones provocadas por otros agentes, solo hay un agente que provoque realmente la lesión. La importancia de los postulados de Koch consiste en la utilización de los cultivos puros, cosa que es necesaria para discernir el verdadero causante de la enfermedad.

Aunque la mayoría de las bacterias infecciosas causantes de la enfermedad en humanos cumplen los postulados, hay algunas excepciones. Mycobacterium leprae, no se ha podido cultivar in vitro como cultivo puro, por lo que incumple el tercer postulado. Solo se ha podido cultivar in vivo en las almohadillas de las patas de un armadillo.

Actualmente los postulados de Koch constituyen la piedra angular de cualquier estudio sobre la etiología de una enfermedad y son una herramienta de vital importancia para la rápida identificación de nuevos patógenos (enfermedades emergentes y reemergentes) con el fin de aplicar tratamientos preventivos. Pese a las muchas teorías formuladas en su contra, apenas han sufrido modificación alguna conservando toda su vigencia y validez.

Fuente:

Fuentes Castillo C. (2007) Los postulados de Koch: Revisión histórica y perspectiva actual, Revista Complutense de Ciencias Veterinarias Vol. 1 (2) p.262-266.

Pineda Vásquez ME., Microbiología: Aspectos Históricos, Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira.

El Puercoespín – Coendou spp.

Coendou spp.

Puercoespín (Coendou spp.)

En unos de mis recorridos en el Parque Metropolitano de la Ciudad de Panamá, se logró avistar esta especie de Puercoespín (Coendou spp.) descansando en una rama de un árbol de mango a pocos metros de un punto de control en el Parque.

Este animal forma parte de los puercoespines de Nuevo Mundo (Erethizontidae), los cuales son roedores caviomorfos, arbóreos, que tienen como mecanismo de defensa púas peligrosas y se alimentan de hojas, corteza, frutos y semillas inmaduras. Tienden a ser solitarios nocturnos y silenciosos, son díficiles de observar.

Las especies que ocurren en el istmo de Panamá son Coendou mexicanus (Desde México al oeste de Panamá) y Coendou quichua (Desde Panamá hasta el Ecuador, Andino y trans-Andino). Sin embargo en la imagen por las características morfológicas en mi apreciación parece un Coendou prehensilis (Desde Colombia al norte de Argentina).

La distribución de los puercoespines a nivel general ocurre en hábitats tropicales y subtropicales desde el sur de México hasta el Norte de Argentina. En su mayoría habitan la selva baja, pero algunos también se encuentran en los bosque secos (caducifolios), y otros se encuentran en los bosques montanos (“nubosos”) a unos 3500 metros sobre el nivel del mar.

Coendou spp.

Puercoespín (Coendou spp.)

 

La taxonomía actual reconoce 15 eretizóntidos en tres géneros. Dos géneros incuyen cada uno una sola especies viviente: Chaetomys y Erethizon. Las 13 especies restantes pertenecen a Coendou, pero algunos autores han reconocido subgéneros o géneros adicionales dentro de este grupo, por ejemplo, refirieron varias especies de pelaje largo de Coendou al género Sphiggurus.

La taxonomía a nivel de especie de Coendou es algo problemática porque muchas especies en este género se describieron solo en base a características del pelaje y se ha indicado falta de revisiones taxonómicas detalladas del tipo de material de estudio como la principal fuente de confusión en relación a la taxonomía de eretizóntidos.

Coendou prehensilis tiene una variación geográfica considerable y este puede ser un complejo de especies. Esta especie figura como la menos preocupante considerando su amplia distribución, su presunta gran población y no se espera que disminuya la tasa requerida para su inclusión en una categoría amenazada. Hasta la fecha se reporta en los siguientes países: Argetina, Bolivia, Brasil, Colombia, Guayana Francesa, Guyana, Paraguay, Perú, Surinam, Trinidad y Tobago y Venezuela.

Abajo les dejo un reportaje local sobre los puercoespines, donde mencionan el mito de si éstos animales son capaces de lanzar sus espinas, espero sea de su agrado.

https://www.tvn-2.com/videos/noticias/puercoespin_2_4975772440.html

Fuente:

  1. Voss RS, Hubbard C & Jansa SA (2013) Phylogenetic Relationships of New World Porcupines (Rodentia, Erethizontidae): Implications for Taxonomy, Morphological. Evolution, and Biogeography, American Museum Novitates, 3769, p. 36
  2. Marinho-Filho J & Emmons L (2016) Coendou prehensilis. The IUCN Red List of Threatened Species 2016: e.T101228458A22214580. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T101228458A22214580.enDownloaded on 25 August 2018.
  3. Caldara Junior V & Leite YLR (2012) Geographic variation in hairy dwarf porcupines of Couendou from eastern Brazil (Mammalia: Erethizontidae), Zoologia 29 (4): 318-336 doi:10.1590/S1984-46702012000400005

Tratamiento de aguas de desecho minero

La actividad minera genera una gran cantidad de contaminantes que son vertidas directamente en los ríos.  Para ello también existen maneras de regular la contaminación que es vertida en las aguas. En el caso de la minería, la corrección de las aguas ácidas  se puede realizar con 2 tipos de tratamientos:

  • Tratamiento activo: es decir métodos ortodoxos, que precisan del uso de reactivos sintéticos, impulsados para energía externa y sedimentación intensificada.
    • Precipitación de Hidróxidos: La mayoría de los sistemas de tratamiento activo para aguas ácidas de las minas en Europa están basados en la precipitación de hidróxidos. Esta precipitación se realiza en un proceso de tres pasos:
      • Oxidación para convertir el hierro de ferroso a férrico — La Oxidación se realiza tradicionalmente por una cascada de aireación.
      • Dosis de álcalis (especialmente Ca (OH)2, pero también con Na(OH)2, NaHCO3 y otras sustancias) cada reactivo tiene sus propias ventajas e inconvenientes. Generalmente el reactivo más económico es la cal apagada. Sin embargo, donde se precisa precipitar altas concentraciones de Mn, Zn o Cd, la sosa cáustica suele resultar más barata todavía. Para espacios pequeños de zonas de tratamiento se puede usar amoníaco en forma de gas.
      • Sedimentación: frecuentemente ofrece las oportunidades más importantes para intensificación del proceso del tratamiento en su totalidad. Eso es porque el proceso de sedimentación gobierna la densidad del lodo de hidróxidos producidos, que a su vez controla el volumen de residuos que se precisa recoger.

Un problema significativo asociado con la precipitación activa  de hidróxidos es que aumenta la salinidad total del agua por adición  de Ca2+ o Na+.

  • Tratamiento Pasivo: que implica el tratamiento en sistemas estáticos como humedales en los cuales se mejora la calidad del agua por reacciones biogeoquímicas sin el empleo de reactivos sintéticos o energía externa. Los métodos apreciables para aguas alcalinas de minas, es decir aguas contaminadas solamente por Fe y Mn, son bien desarrollados y consisten en usar humedales aeróbicos. Existen muchos ejemplos de la mala aplicación de humedales aeróbicos para aguas ácidas, porque los procesos estimulados en humedales aeróbicos resultan en la hidrólisis del hierro, un proceso que libera  ácido protónico. Sin embargo, una vez que se ha corregido la acidez del agua de laa mina por otro tipo de sistema pasivo, se puede usar un humedal aeróbico como paso final, par remover los últimos mg/l de hierro. Los principales métodos actuales para el tratamiento pasivo de aguas ácidas de minas son:
    • Tecnologías con minerales carbonatos: Un enfoque obvio para el tratamiento pasivo de aguas ácidas pretende imitar lo que ocurre en la naturaleza y neutralizar aguas ácidas para la disolución de minerales carbonatos. El mineral carbonatado más útil en el tratamiento pasivo es la calcita (CaC03), que se disuelve mucho más rápidamente que la dolomia (CaMg(C03)2). En Estados Unidos se usa caliza en sistemas de tratamiento pasivo se inició por la construcción de drenaje anóxicos de caliza.
    • Tecnologías pasivas que aprovechan reducción bacteriana de sulfatos: El proceso de reducción bacteriana de sulfatos brinda la posibilidad de combatir acidez, reducir la alcalinidad de los bicarbonatos disueltos y remover metales del agua mediante la precipitación de sulfuros. La precipitación por estos sistemas se puede dar por 3 sistemas diferentes:
      • Humedales de abono, con sustratos espesos de abono, en los que se mantienen condiciones anaeróbicas que promocionan reducción bacteriana de sulfatos.
      • Sistemas de flujo subterráneo con reducción bacteriana del sulfato, entre los que están comprendidos barreras reactivas permeables para aguas subterráneas y otros sistemas parecidos que se apliquen para descargas superficiales de aguas ácidas.
      • Sistemas reductores y productores de alcalinidad: Un proceso típico consta de una capa de abono encima de una capa de gravas de caliza. El flujo se dirige verticalmente para el abono y luego para la capa de áridos de caliza.
Reduccion Bacteriana de Sulfatos

Reduccion Bacteriana de Sulfatos

Vamos a ampliar sobre la reducción bacteriana de sulfatos, ya que las aguas ácidas de las minas contienen concentraciones muy altas de sulfatos. Existen varios géneros de bacterias que catalizan la reducción de sulfatos a sulfuros. Hasta la fecha, no se han visto aplicaciones de esta tecnología a escala real para aguas de minas a excepción del ingenio de Zinc en Holanda. Sin embargo se han visto aplicaciones exitosas a escala piloto en  la mina Wheal Jane, UK, de mostrando que los procesos de RBS ocupan un nicho importante en dos circunstancias comunes:

  • Donde la desalinización de las aguas es imprescindible.
  • Donde existe aguas altamente contaminadas por metales valiosos (Cu, Zn) para que para varios procesos activos de RBS brinden posibilidades de recuperación de estos metales como materias primas.

Entre las  posibles acciones de los procesos activos de RBS hay dos muy notables:

  • La utilización de mezcla de gases H2 y CO2 y etanol como una fuente de cromo una fuente de carbono para las bacterias. El proceso saca tanto metales como sulfatos de las aguas de minas dejando concentraciones residuales muy bajas. Los procesos obtienen lodo con bajo contenidote carbono y altas concentraciones de sulfuros, que en circunstancias aptas suelen proporcionar beneficios económicos en minería de metales. En un paso secundario de oxidación, es posible también obtener sulfuro, una mercancía también rentable.
  • Otros procesos son un ejemplo impresionante de varias tecnologías que se conocen como biodesalinización; este concepto es la utilización de una fuente residual de carbono para estimular la reducción bacteriana en aguas ácidas de mina. Este proceso realiza el tratamiento simultáneo de dos fuentes de residuos, sin utilizar reactivos costosos, también se controlan la reoxidación de sulfuros disueltos para recuperar el azufre en la forma rentable.

Fuente:

  1. Sánchez Luis Enrique (1995) Manejo de Residuos Sólidos en Minería, Capítulo 15, II Curso Internacional de Aspectos Geológicos de Protección Ambiental, 239 – 250.
  2. Younger Paul L. (2005) Corrección de Aguas ácidas de Minas, Aplicación de Métodos Activos y Pasivos en Europa.

Nephila clavipes – Alias araña de seda dorada

Nephila clavipes

Nephila clavipes – araña de seda dorada – Cerro Ancón

La Nephila clavipes mejor conocida como araña de seda dorada se encuentra ampliamente distribuida en toda América desde el sudeste de los Estados Unidos hasta Argentina. Su principal característica es su tela de color amarillo o dorado brillante que emplea para la captura de presas.

Esta red ha sido de interés de estudio por ser soprendentemente fuerte y pesada. Éstas arañas construyen dos tipo de tela, una para capturar presas y otra que sirve de barrera para protegerse contra sus predadores. Se encuentran en general en grupo de varias telas asociadas, frecuentemente infestadas por micro arañas que se aprovechan de la enorme red para capturar a sus presas.

 Las hembras jóvenes son las encargadas de construir la estructura que es similar a una escalera (stabilimentum). La red puede medir un metro cuadrado, la cual es construida por pequeñas hembras sobre y debajo del área de descanso.

La red son comúnmente ocupadas por otras arañas (Por ejemplo: Argyrodes) que no son detectadas o son toleradas por las constructoras de la red. Se consideran cleptoparásitos, robando presas capturadas en la red hospedera.

Su presencia probablemente sea la razón del constante traslado de las redes a un nuevo sitio por parte del huésped. Se han observado moscas del género Phyllomyza viviendo en el cefalotórax de una Nephila en Panamá

Su alimentación se basa en pequeños insectos voladores y raramente de pequeños colibríes capturados en sus telas. La hembra son seis a siete veces más grande en relación a los machos y éstos últimos tienen una gran competición por las hembras.

Se distribuyen en áreas de alta humedad y en relativo espacio abierto en toda América, desde el sudeste de los Estados Unidos hasta Argentina, Perú y todo Brasil. Su tamaño oscila entre 0.5 cm y las hembras de 3 a 4 cm.

Referencias:

  1. Kraus JE, Höfling E, Trefaut Rodrigues M, de Sampaio MRA, Fauna e flora no campus da Cidade Universitária Armando de Salles Oliveira,  p.52
  2. Hogue CL, Latin American Insects and Entomology, Terrestrial arthropods and primitive insects, Golden Silk Spider, p.120-121

Alternativas a la muerte celular: Autofagia

Autofagia

Proceso de la Autofagia

Los cambios en el metabolismo juegan un importante rol en la capacidad de la célula a adaptarse al estrés. Cuando el cuerpo es expuesto a diversas fuentes de estrés, la respuesta puede darse en una variedad de formas como, activando vías que promuevan la supervivencia a la muerte celular [1].

Cuando estímulos nocivos no son resueltos, la célula activa vías de señalización de muerte. La supervivencia de la célula depende de la capacidad de montar una respuesta apropiada frente al estrés ambiental o intracelular. La célula trata de defenderse y recuperarse de la agresión externa [2].

De acuerdo al nivel de estrés, la célula puede establecer diferentes tipos de mecanismos de defensa y estrategias de supervivencia. Si éstas estrategias no son exitosas, la muerte celular programada es activada, con el objetivo de eliminar el daño celular del organismo [2].

Una de éstas respuestas es la autofagia. Éste proceso es regulado por la vía de degradación lisosomal que mantiene la homeóstasis celular y actúa como un regulador que controla la calidad del citoplasma, eliminando proteínas que se agregan y organelos dañados, dentro de una vesícula con doble membrana, conocida como autofagosoma [1].

El proceso de autofagia comienza, cuando el autofagosoma maduro se fusiona con el lisosoma para formar un autolisosoma, dónde  el contenido citoplasmático es degradado [3]. Ésta vía de degradación controla muchos mecanismos fisiológicos y biológicos durante la patogénesis de diversas enfermedades.  Hallazgos recientes han mostrado que la autofagia es un proceso catabólico conservado en la mayoría de organismos eucariontes a la respuesta al estrés tal cual la limitación de nutrientes [4].

El descubrimiento de los genes relacionados a la autofagia en levadura inicialmente, ha mejorado el conocimiento de mecanismos moleculares involucrados en el control de la autofagia [4].

Este proceso es típicamente observado en células que están expuestas a estrés metabólico y terapéutico, incluyendo la limitación de factores de crecimiento, inhibición del receptor de la tirosina quinasa,  La vía de señalización de  la diana de rapamicina en células de mamífero o mTOR, limitación de nutrientes, isquemiainhibición de la degradación proteasomal y estrés a nivel del retículo endoplasmático [2].

En el caso de estrés en el retículo endoplasmático, se ha mostrado que la autofagia es inducida a través de la activación del sensor de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) IRE1 y la activación “downstream” de la quinasa c-Jun N terminal (JNK), el cual puede regular la disociación de Beclin-1 [5].

Beclin-1 es una proteína que es producto de un gen supresor de tumores y el homologo en mamíferos del gen 6 relacionado con la autofagia (Atg6) y forma un complejo multiproteínico con Vps34 [1] [3]. La ATGs regula varios en el proceso de autofagia [6]. Ellos forman diversos complejos proteínicos en pasos secuenciales controlando la formación del autofagosoma [6].

El complejo multiproteínico se une también con la fosfatidilinositol 3 – quinasa de clase II, UVRAG (UV irradiation resistance associated tumor suppresor gene),  y una quinasa miristilada (Vps, ó p150 en humanos) [2].

El complejo multiproteínico es requerido para la iniciación del autofagosoma. Cuando éste complejo se forma, Vps34 se activa y cataliza la generación de fosfatidilinositol 3 – fosfatasa, el cual es requerido para la nucleación de vesículas [2].

Las especies reactivas al oxígeno (ROS) puede ser una fuente común de estrés celular y de autofagia. La acumulación de ROS ha sido reportada como resultado de la inactivación de la cisteína proteasa ATG4, la cual causa la acumulación del precursor de la ATG8 – fosfoetanolamina requerida por el ROS para la iniciación de la formación del autofagosoma. En algunas circunstancias, la autofagia constituye una ruta alternativa a la muerte celular, mientras que en algunas circunstancias, es una ruta alternativa a la muerte celular [2] [1].

Recientemente, los científicos debaten sobre cuando la autofagia es protectiva o tóxica para las células. Las evidencias sugieren que tiene roles beneficiosos en el corazón bajo condiciones fisiológicas [2].

Se ha demostrado que la autofagia regula la renovación intracelular de proteínas y organelos en el corazón y protege contra estrés hemodinámico. En concordancia con éste reporte, la rapamicina, el cual induce la autofagia inhibiento mTOR, puede proteger el miocardio contra la isquemia/lesión por reperfusión [2].

Por otro lado, existe reportes contradictorios de la regulación negativa  de los factores de transcripción (ATF5 o ATF7). El uso de el siRNA previene el estrés inducido por la muerte celular, sugiriendo, que el nivel o el tiempo de la autofagia puede ser crítico para decidir el destino de la célula.

A un nivel molecular existe evidencias de comunicación entre la apoptosis y la autofagia, particularmente en relación con la familia Bcl-2. Éstas interrogantes requieren más estudios con el objetivo de describir los mecanismos y vías que involucran todos estos procesos

 

Referencias:

1) Goldsmith, J., Levine, B., Debnath, J. (2014) Chapter 2 – Autophagy and Cancer Metabolism. Methods in Enzymology Vol. 542 p. 25-57.

2) Fulda, S., Gorman, A. M., Hori, O., & Samali, A. (2010) Cellular stress responses: cell survival and cell death. International journal of cell biology, 2010.

3) Chen, Steve S.L., Ke, Po-Yuan (2014). Chapter 9 – Suppression of Innate Antiviral Immunity after Hepatitis C Virus Infection: Role of the Unfolded Protein Response and Autophagy. Autophagy: Cancer, Other Pathologies, Inflammation, Immunity, Infection, and Aging., p. 137-159

4) Besteiro, S., (2014) Chapter 12 – Autophagy in Parasitic Protists, Autophagy: Cancer, Other Pathologies, Inflammation, Immunity, Infection, and Aging, p. 185-195.

5) Vidal, R. L., Matus, S., Bargsted, L., & Hetz, C. (2014). Targeting autophagy in neurodegenerative diseases. Trends in pharmacological sciences.

6) Duque, T. L. A., Souto, X. M., de Andrade-Neto, V. V., Ennes-Vidal, V., & Menna-Barreto, R. F. S. (2013). Autophagic Balance Between Mammals and Protozoa: A Molecular, Biochemical and Morphological Review of Apicomplexa and Trypanosomatidae Infections.

Principios de Cromatografía

Cromatografía

La Cromatografía es un método físico de separación en el cual, los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientas que la otra se desplaza en una dirección definida. La fase móvil pasa sobre y a través de la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla idealmente se equilibran o se separan de forma diferencial entre las dos fases, resultando en diferentes velocidades de migración en el sistema en proporción a su interacción con la matriz sorbente.

El proceso de sorción y desorción  ocurre varias veces a medida que la molécula se mueve a través de la matriz y el tiempo que requiere depende principalmente de la propoción de tiempo en que es sorbido y mantenido inmóvil. La separación es efectuada en varios componentes de la matriz a diferentes tiempos, lo que es conocido como tiempo de retención.

El modo de interacción entre los componentes y las dos fases pueden ser clasificadas en dos tipos, aunque muchos procesos de separación son combinaciones de ambas. Si la muestra es atraída a la superficie de una de las fases (usualmente la superficie de la fase estacionaria sólida) el proceso es conocido como adsorpción. Alternativamente, si la muestra difunde en el interior de la fase estacionaria, el proceso es llamado partición.

La fase móvil puede ser líquido o un gas. Basado en la naturaleza de la fase estacionaria y móvil las técnicas cromatográficas se pueden clasificar como se muestra a continuación:

  •  Cromatografía de Adsorpción: Esta basada en la diferencia en los coeficientes de adsorpción. La fase estacionaria puede ser un sólido por ejemplo, aluminio, óxido de magnesio, gel de silica, etc. Los solutos son adsorbidos en partes diferentes en la columna. Los componentes adsorbidos son eluidos pasando un solvente apropiado a través de la columna.
  • Cromatografía de Partición: La fase estacionaria puede un líquido fuertemente adsorbido en un sólido que funciona como soporte. En este caso, el soluto se distribuye entre la fase estacionaria en la fase móvil líquida.
  • Cromatografía de gas: Este tipo de cromatografía se da en fases móviles que consisten en mezcla de gases o cromatografía de fase de vapor.

El método cromatográfico de sepraración, en general, conlleva los siguientes pasos:

  • Adsorpción o retención de substancias en la fase estacionaria: La fase estacionaria puede ser un sólido o líquido y la fase móvil puede ser un líquido o gas.
  • Separación de las substancias adsorbidas: La separación ocurre porque la combinación de dos o más factores como las velocidades de migración, la capilaridad, grado de adsorción, etc.
  • Recuperación de las sustancias separadas por un flujo continuo de la fase móvil (elución)
  • Análisis cualitativo y cuantitativo de las sustancias eluidas.

Los métodos cromatográficos pueden ser clasificados en base a su fase estacionaria y la fase móvil utilizada. En las columnas cromatográficas cuyo principio es la adsorción, la fase móvil líquida se le deja percolar sobre la fase estacionaria; que generalmente se encuentra empacada en una columna vertical. La fase estacionaria compite por el soluto por adsorción y la fase líquida móvil compite por el soluto por disolución.

En este tipo de cromatografía a veces, ambas fases son líquidas. El método es entonces llamado, cromatografía de partición. El líquido usado como fase estacionaria es esencialmente insoluble en el líquido usado como fase móvil. Generalmente la cromatografía de partición es realizada humedeciendo la matriz sólida con el líquido que va a ser utilizado como fase estacionaria, después de este procedimiento la matriz sólida es empacada en la columna. El líquido entonces se inmoviliza y se vuelve la fase estacionaria. La separación de substancias en este caso se debe a las diferencias en la solubilidad de los solutos en dos líquidos. Este proceso se conoce también como cromatografía de partición en columna

La clasificación mencionada previamente se basa en las fases involucradas en el proceso cromatográfico, existe una gran variedad de combinaciones de fases y procesos que incrementan el gran número de métodos con nombres propios:

  • Cromatografía líquida: una clasificación útil de las diversas técnicas de CL esta basado en el mecanismo de distribución aplicado en la separación.  En la práctica la mayoría de las separaciones en CL son resultado de mecanismos mixtos de separación.
    • Separación por Fase Normal: En cromatografía líquida de fase normal, la fase estacionaria es una sustancia polar y la fase móvil es generalmente una mezcla de solventes no acuosos. Compuestos no polares que son solubles en hexano pueden ser analizados por cromatografía de fase normal en sílica o alumina.
    • Separación por Fase Reversa: La mayoría de las aplicaciones en cromatografía líquida son realizadas con la metodología de fase reversa, donde tenemos una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La cromatografía líquida de fase reversa es aplicada para el análisis de analitos iónicos y polares, los cuales no son compatibles con los análisis en cromatografía de gases. La cromatografía de fase reversa presenta mayores aplicaciones en compuestos con una amplio rango de polaridades y compuestos que la metodología de Fase Normal.
    • Cromatografía electrocinética: Esta metodología es llevada a cabo en tubos capilares y la movilidad es generada por la aplicación de un potencial eléctrico pero la separación se logra como resultado de la interacción con una fase estacionaria micelar, formada por surfactantes y agregados a la fase móvil. de esta forma la cromatografía electrocinética, une los elementos de la cromatografía líquida y de la electroforesis capilar.
    • Cromatografía de Afinidad: Las biomoléculas son purificadas utilizando técnicas que separan de acuerdo a las diferencias en propiedades específicas. Esta técnica separa proteínas en base a su interacción reversible con ligandos acoplados a una matriz cromatográfica.
    • Cromatografía de Exclusión molecular: Separa moléculas de acuerdo a las diferencias en tamaños a medida que pasan a través de un medio de filtración empacado en una columna. Esta técnica es apropiada para biomoléculas que pueden ser sensitivas a cambios en el pH, concentración de metales iónicos o cofactores. La matriz es porosa compuesta por partículas esféricas con estabilidad física y química. La matriz es equilibrada con buffer el cual llena el espacio entre los poros y las partículas
    • Cromatografía de Intercambio de Iónico: Las biomoléculas son separadas de acuerdo a las diferencias en su carga neta de superficie. Esta técnica es empleada frecuentemente en purificación de proteínas, peptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas ofreciendo una alta resolución. La técnica es capaz de separar especies moleculares que tengan solo pequeñas diferencias en sus propiedades, en este caso la carga. El intercambio iónico se basa en las diferencias de las afinidades de analitos individuales.
  • Cromatografía de gases: Las muestra es normalmente introducida como vapor en la columna cromatográfica, la solubilidad de cada componente en la fase gaseosa es dependiente de su presión de vapor y causa que las moléculas de cada componente se particionen entre la fase móvil y la fase estacionaria. Siempre que una molécula entra en su fase gaseosa ésta es barrida al detector por el flujo del gas transportador. Finalmente, los compuestos que presenten diferencias en sus propiedades físicas y químicas llegarán al detector en tiempos diferentes. La fase estacionaria puede ser sólida o un líquido cubriedo una soporte sólido inerte.

En cromatrografía, el detector mide un parámetro físico del efluente de la columna o de los componentes de la columna y los transforma en una señal eléctrica. Un detector universal mide un grupo de propiedades del efluente, mientras que un detector específico mide un parámetro particular.

Un detector puede ser un dispositivo sensible a las concentraciones , el cual da una señal que es en función de la concentración de un analito en la muestra, o un dipositivo sesible al flujo de masas; dónde la señal es proporcional al flujo de masas del analito. Junto al espectrómetro de masas, una serie de otros detectores se utilizan en diversas aplicaciones:

  • El detector UV  de absorbancia: éste detector es el más empleado en cromatografía líquida, el cual es un detector específico con una amplia gama de aplicaciones. La detección es basada en la absorción de fotones por un cromóforo táles como: anillos aromáticos, dóbles enlaces y algunos hetero-átomos. De acuerdo a la ecuación de Lambert-Beer, el detector UV es un dispositivo sensible a la concentración.
  • Detector de fluorescencia: es un detector específico y sensitivo a la concentración. Esta basado en la emisión de fotones por molécuas excitadas electrónicamente. La fluorescencia es especialmente observada por analitos con grandes sistemas de anillos conjugados, hidrocarburos aromáticos polinucleares y sus derivados.
  • Detector de dispersión de luz evaporativo: es un detector universal basado en la habilidad de las partículas de causar la dispersión de fotones cuando ellas atraviesan un haz de rayo policromático o luz. El líquido efluente de CL es nebulizado. El aerosol resultante es dirigido a través del rayo de luz. Éste detector es un dispositivo sensitivo al flujo de masas, el cual provee una respuesta directamente proporcional a la masa del analito no volátil. Cómo puede detectar compuestos que no son detectables en otras técnicas de detección, el detector es frecuentemente usado en conjunto al espectrómetro  de masas con el propósito de obtener el análisis completo de la muestra.
  •  Detector térmico de conductividad: Es un detector sensitivo a la concentración, no destructivo, universal que responde a la diferencia de conductividad térmica del gas puro y el gas portador del analito. El DTC es generalmente usado para detectar gases permanentes, hidrocarburos ligeros y compuestos que respondan pobremente al detector de ionización de flama.
  • Detector de ionización de flama: Con una respuesta casi universal a compuestos orgánicos, bajos límites de detección, estabilidad a largo plazo, simplicidad en su operación y construcción. El DIF, responde a la combustión de compuestos orgánicos en una pequeña llama de difusión de hidrógeno. El gas transportador de la columna es mezclado con hidrógeno y quemado en un pequeño orificio en una cámara a través del cual sale el exceso de aire. Un electrodo colector cilíndrico es localizado a pocos milímetros sobre la flama y la corriente de iones es medida por pequeños voltajes establecidos.

Referencias

  1. Wixom RL, Sehrke CW. (2011) Chromatography: A Science of Discovery, Ed. Wiley and Sons
  2. Niessen Wilfried MA. (2006) Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, 3rd edition, Ed. Taylor and Francis.
  3. Miller JM., (2005) Chromatography: Concepts and contrast, Ed. Wiley.