Pruebas Microbiológicas para E. coli

Más de un estudiante ha pasado por la situación, de no conocer exactamente que medios son los indicados para identificar

E. coli – Salmonella Shigella Agar

una cepa bacteriana específicamente, aunque haya revisado el tema en clases recientes. Por ello es práctico conocer sobre qué tipo de medios las bacterias se diferencian de otras cepas aunque sean metabólicamente muy similares. En este apartado revisaré las pruebas más relevantes para identificar a la muy estudiada Escherichia coli.

Cuando recibimos una muestra es importante definir el algoritmo de pruebas que debe manejarse para lograr identificar el microorganismo de interés. La tinción de Gram nos permite definir si el microorganismo es Gram positivo o Gram negativo en este caso en el frotis debemos observar bacilos Gram negativos para seguir a las siguientes pruebas de caracterización.

E. coli – MacConkey

La mayoría de los microorganismos pueden cultivarse sobre substratos nutritivos para el estudio de sus propiedades o para la utilización de ciertas propiedades en condiciones controladas. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos dónde intervienen factores físicos como: temperatura, pH, el factor redox entre otras.

Al momento de tener una muestra en donde se desee identificar la presencia de E. coli hay que definir que medios de cultivo son selectivos para enterobacterias. Los medios selectivos son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas que poseen una flora abundante.

Los medios selectivos incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo bacteriano que no sea de interés pero en cambio permite el crecimiento de otros grupos.

Para microorganismos entéricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagación  de los bacilos entéricos Gram negativos.

E. coli- Agar EMB

Otra tipos de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificación de microorganismos entéricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes químicos e indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

  • Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas, como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
  • Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
  • Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
  • Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico.

Pruebas Bioquímicas son  la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:

  • Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.
    • Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad para la producción de H2S en cepas de E. coli.
  • Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba detecta la producción de  la enzima β-galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos que no la utilizan. La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa, el cual es  inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
    • E. coli es positiva para esta prueba
  • Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la cual produce la hidrólisis de la gelatina.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de glucosa.
    • 99% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.
    • esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
  • Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima fenilalanina desaminasa es útil para diferenciar inicialmente a las especies de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos gram negativos.
    • 0% de positividad para cepas de E. coli.
  • Producción de descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas especies bacterianas poseen enzimas que tienen la capacidad de descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos entre ellos la arginina, lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina y CO2.
    • 17% de positividad para Arginina.
    • 90% de positividad para Lisina.
    • 65% de positividad para Ornitina.
  • Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.
    • 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptofano.  Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.
    • 98% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.
    • 1% de positividad para cepas de E. coli.
  • Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas bacterias de utilizar el malonato como fuente de carbono y energía.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el nitrato a nitrito o gas. Es útil en la identificación de la familia Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos otros grupos de microorganismos.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo de base púrpura de bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una concentración del 1% para la determinación de la fermentación de carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
    • D-Sorbitol 94% de positividad.
    • Lactosa 95% de positividad.
    • Sacarosa 50% de positividad.
    • D-Manitol 98% de positividad.
    • D-Adonitol 5% de positividad.
    • L-Arabinosa 99% de positividad.
    • Maltosa 96% de positividad.

Fuente:

Rojas N, Chaves E, García F (2006) Bacteriología Diagnóstica, Costa Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología.

García R, Córdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria

Imágenes:

Cabronio 5.9, Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas, http://es.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas

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¡Brote de E. coli en Europa!

En estas semanas se han emitido constantes reportes en noticiarios y medios escritos sobre el brote de E. coli que afecta actualmente a Europa.  En Alemania este brote ha causado 18 muertes y se ha expandido a otros 11 países.

Escherichia coli

Escherichia coli

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reportado que se ha identificado una mutación en la cepa de E. coli causante de los brotes.

Según el portavoz de la OMS Aphaluck Bhatiasevi:  “Esta mutación nunca ha sido vista anteriormente en un brote”. Este nuevo brote de E. coli ha enfermado alrededor de 1.600 personas dentro de las cuales 499 sufrieron alguna complicación.

La Escherichia coli, ha sido parte de un sin numero de ensayos de más de un estudiante de pregrado, es parte de nuestra flora normal y no deja de ser interesante el hecho de que ante ciertas circunstancias logre volverse en un asesino potencial.

El género Escherichia se compone de cinco especies, de la cual la E. coli, es la más conocida y más relevante a nivel clínico. Esta bacteria es asociada a varias enfermedades como septicemias, meningitis y gastroenteritis.

Se han descrito un gran número de antígenos como: O, H y K, los cuales se utilizan para clasificar a las cepas con fines epidemiológicos. Algunos serogrupos presentan una mayor virulencia.

Dentro de los factores de virulencia  de las cepas de E. coli están:

  • Las adhesinas: Es la capacidad de adherencia a las células en ciertas localizaciones para evitar ser eliminado por el efecto de arrastre de la orina en el caso de que se encuentre dentro del aparato genitourinario. Las cepas de E. coli poseen una variedad de adhesinas especializadas como: factores de antígenos del factor de colonización,  fimbrias de adherencia y agregación, pili que forma haces, intimina, pili P, proteína Ipa y fimbrias Dr.
  • Las exotoxinas:  Entre las toxinas producidas por la E. coli podemos mencionar la Shiga Toxina, las toxinas termoestables y las toxinas termolábiles.  En el caso de las hemolisinas tienen una gran importancia en la patogenia de la enfermedad producida por la E. coli uropatógeno.

Cuando una persona adquiere una infección por E. coli puede sufrir algunos de los siguientes eventos clínicos:

  • Septicemia: en este caso tenemos infecciones que provienen del tracto gennitourinario o digestivo. Existe una alta mortalidad asociada a la septicemia en especial cuando esta afectada la inmunidad, o cuando está involucrado el abdomen o el sistema nervioso central
  • Infección del aparato urinario: Este tipo de infecciones se originan en el colon donde desciende y contamina la uretra y de ahí asciende hasta la vejiga, donde puede migrar hasta el riñón o la próstata. La mayoría de las cepas tienen el potencial de generar este tipo de infecciones, son ciertos serogrupos los que generan con mayor frecuencia este tipo de infección específicamente. Estos serogrupos tienen una mayor virulencia por su capacidad de producir adhesinas, las cuales se unen a las células que recubren la vejiga y el aparato urinario superior y por las hemolisinas que lisan las hematíes y otro tipos de células conllevando a una respuesta inflamatoria.
  • Meningitis neonatal: La E. coli  junto a los estreptococos del grupo B son los agentes causales de las infecciones del sistema nervioso central en los niños menores de 1 mes. Un porcentaje de las cepas de E. coli poseen el antígeno capsular K1. En mujeres embarazadas y en los recién nacidos este microorganismo está presente en el aparato digestivo, pero se desconoce el mecanismo por el cual este serogrupo ocasiona la enfermedad en los neonatos
  • Gastroenteritis: Las cepas que ocasionan la gastroenteritis se subdividen en:
    • E.coli enteropatógena (ECEP): Esta cepa afecta el intestino delgado. Es el gente causal de la diarrea infantil en países subdesarrollados; en este caso se observa una diarrea acuosa y vómitos. No hay heces sanguinolentas. La infección se caracteriza por la adhesión bacteriana a las células epiteliales del intestino delgado con la destrucción posterior de las microvellosidades (histopatología por unión/borrado [U/B]).
    • E. coli Enterotoxígena (ECET): Esta cepa afecta el intestino delgado. Esta cepa causa la conocida diarrea del viajero, diarrea infantil en países subdesarrollados, diarrea acuosa, vómitos, espasmos abdominales, náuseas, febrícula. Los mecanismos de patogenia de esta cepa  son las enterotoxinas termoestables y/o termolábiles, mediadas por plásmidos que estimulan la hipersecreción de líquidos y electrolitros.
    • E. coli Enterohemorrágica (ECEH): Esta cepa afecta el intestino grueso. Inicialmente causa una diarrea acuosa, seguida con una diarrea sanguinolenta (colitis hemorrágica) con espasmos abdominales; sin fiebre o con febrícula. Puede progresar a síndrome hemolítico urémico. En esta cepa la patogenia esta mediada por las Shiga Toxinas (Stx-1, Stx-2), que interrumpen la síntesis de proteínas. Causa las lesiones U/B en las células epiteliales y posee un plásmido de 60 MDa que transporta genes de otros factores de virulencia. Hay destrucción de la microvellosidad intestinal, que da lugar a la disminución de la absorción.
    • E. coli enteroinvasiva (ECEI): Esta cepa se aloja en el intestino grueso, es común en países subdesarrollados. Puede presentar fiebre, espasmos, diarrea acuosa, puede progresar a disentería con escasas heces sanguinolentas. En este caso la invasión esta mediada por un plásmido y destrucción de las células que recubren el colon.
    • E. coli enteroagregativa (ECEA): En esta cepa el lugar de acción es el intestino delgado. Causa diarrea infantil en países subdesarrollados, diarrea del viajero, diarrea acuosa persistente con vómitos, deshidratación y febrícula. La patogenia esta mediada por la adherencia agregativa de los bacilos por un plásmido con acortamiento de las microvellosidades, infiltración mononuclear y hemorragia; también se observa una  disminución en la absorción de líquidos.

Observando la gran variedad de cepas con alto grado de virulencia, es momento de analizar si el agente causal de la enfermedad en Europa será un candidato para pertenecer a esta lista de cepas con nuevas características en cuanto a inmunidad y patogenicidad.

 

Fuente:

Murray PR, Rosenthal KS, Pfaüer MA  (2006) Microbiología Médica, 5ta Ed., Madrid, España: Elsevier España S.A.

Xinhua (2011)  OMS indica que brote de E. coli en Europa es provocado por nueva mutación, La Estrella Online,http://www.laestrella.com.pa/online/al_minuto/2011/06/02/al_min_oms_indica_que_brote_de_e_coli_en_europa_es_provocado_por por_nueva_mutacion.asp, consultado el 7 de junio de 2011.