Identificación Bioquímica de Salmonella spp.

Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium

La identificación de Salmonella spp., es de gran importancia en la industria alimentaria (desde la planta de producción hasta la planta de procesamiento), para reducir la probabilidad de contaminación en alimentos, especialmente cuya fuente sea avícola.

Para la identificación de una bacteria es requerida la aplicación de pruebas bioquímicas, especialmente las pruebas que involucran el metabolismo bacteriano, dónde las enzimas características de cada cepa revelen la identidad de la bacteria a describir.

La identificación bioquímica de una bacteria se conoce como batería bioquímica, dónde se emplea una serie de tubos con medios especiales en los que se va evaluar el metabolismo de la bacterias y las enzimas presentes y ausentes.

El primer paso comienza al lograr aislar las colonias sospechosas de ser de Salmonella spp., éstas deben ser transferidas con un asa bacteriológica en punta estéril a una serie de pruebas bacteriológicas, con los medios de TSI (Triple sugar iron) y LIA (Lysine-iron agar)

El medio TSI, contiene: peptona, agar, lactosa, sucrosa, cloruro de sodio, extracto de carne, extracto de levadura, glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol. Su uso principal es para la diferenciación de miembros de Enterobacteriaceae basado en la fermentación de la lactosa, sucrosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico.

Para la preparación de LIA, se requiere de: agar, L-lisina, digesto pancreático de gelatina, extracto de levadura, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y púrpura de bromocresol, a un pH final entre 6.7 ± 0.2. Su aplicación es para el cultivo y diferenciación de los miembros de Enterobacteriaceae basado en su habilidad de descarboxilar lisina y formas ácido sulfhídrico. Las bacterias que descarboxilan lisina tornan el medio en púrpura y las bacterias que producen ácido sulfhídrico se muestran como colonias negras.

En cada prueba se debe deslizar el asa bacteriológica de forma estríada en la superficie del agar y luego introducir la punta del asa en los medios evaluados. Es importante señalar que el pase de las colonias debe realizarse a partir de una colonia bien aislada, dado que LIA y TSI, son empleadas para seleccionar bioquímicamente colonias sospechosas de Salmonella spp. Si se introduce un cultivo mixto en éstos medios, los resultados pueden ser inespecíficos.

Si las colonias sospechosas son encontradas solo es áreas cargadas de colonias mixtas  en el agar,  es prudente re-sembrar las colonias sospechosas, con el fin de obtener un cultivo puro previo a la inoculación de éstas colonias en TSI y LIA. Estos medio diferenciales deben ser evaluados después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Salmonella en TSI and LIA

Salmonella en TSI and LIA

Es particularmente importante con TSI, ya que una inclinación ácida a las 24 horas a menudo vuelve a ser alcalina con una incubación más prolongada, debido a los componentes proteicos del medio que usan después del agotamiento de los carbohidratos. Las observaciones con respecto al gas y al ácido sulfhídrico son útiles y se debe concentrar la atención en las reacciones al extremo y en la inclinación de los cultivos, independientemente si se manifiesta el ácido sulfhídrico o la producción de gas.

También debemos tener que en cuenta que las muestras de laboratorio que se envían pueden contener varios patógenos entéricos, no solo Salmonella y se pueden agregar agares selectivos/diferenciales para colectar más información para su identificación. Otros medios que se pueden utilizar además de LIA y TSI son:

  • Medio de Indol y Ornitina de motilidad (MIO)
  • Agar de Urea de Christensen
  • Citrato de Simmon
  • Motilidad de ornitina

En un aislado de Salmonella, se espera que en sus pruebas bioquímicas, esta descarboxile la lisina en LIA, fermente la glucosa anaeróbicamente en agar TSI, produzcan ácido sulfhídrico en agar TSI y en LIA. En las pruebas complementarias se espera que utilice el citrato, que tenga incapacidad para hidrolizar urea, producir indol a partir de triptófano.

Las reacciones de azúcar, comprenden la fermentación de glucosa manitol, maltosa y dulcitol y la incapacidad de fermentar lactosa, sacarosa y salicina. Estas reacciones bioquímicas se pueden llevar a cabo convenientemente en los medios compuestos para la identificación bacteriana, como el agar Kohn o  TSI.

Los cultivos que dan las reacciones bioquímicas características de las especies de Salmonella se prueban con los sueros O y H apropiados hasta que se identifican el grupo y el serotipo. Las pruebas bioquímicas para la identificación de salmonellas se pueden combinar para formar una prueba de identificación. Algunos de estos, como los sistemas API 20E o Enterotube II, están actualmente disponibles para su compra.

 

Fuente:

  1. Yousef, Ahmed Elmeleigy. (2003). Food microbiology : a laboratory manual. Hoboken, N.J. :John Wiley & Sons.
  2. Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. In Poultry Diseases (Sixth Edition) (pp. 110-145).
  3. García, M., & Silva, M. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Identificación bioquímica y tipado microbiológico. Unidad didáctica55, 346.
  4. Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2013). Handbook of media for clinical and public health microbiology. CRC Press.
  5. Atlas, R. M. (2006). The handbook of microbiological media for the examination of food. CRC Press.
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Pruebas Microbiológicas para E. coli

Más de un estudiante ha pasado por la situación, de no conocer exactamente que medios son los indicados para identificar

E. coli – Salmonella Shigella Agar

una cepa bacteriana específicamente, aunque haya revisado el tema en clases recientes. Por ello es práctico conocer sobre qué tipo de medios las bacterias se diferencian de otras cepas aunque sean metabólicamente muy similares. En este apartado revisaré las pruebas más relevantes para identificar a la muy estudiada Escherichia coli.

Cuando recibimos una muestra es importante definir el algoritmo de pruebas que debe manejarse para lograr identificar el microorganismo de interés. La tinción de Gram nos permite definir si el microorganismo es Gram positivo o Gram negativo en este caso en el frotis debemos observar bacilos Gram negativos para seguir a las siguientes pruebas de caracterización.

E. coli – MacConkey

La mayoría de los microorganismos pueden cultivarse sobre substratos nutritivos para el estudio de sus propiedades o para la utilización de ciertas propiedades en condiciones controladas. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos dónde intervienen factores físicos como: temperatura, pH, el factor redox entre otras.

Al momento de tener una muestra en donde se desee identificar la presencia de E. coli hay que definir que medios de cultivo son selectivos para enterobacterias. Los medios selectivos son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas que poseen una flora abundante.

Los medios selectivos incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo bacteriano que no sea de interés pero en cambio permite el crecimiento de otros grupos.

Para microorganismos entéricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagación  de los bacilos entéricos Gram negativos.

E. coli- Agar EMB

Otra tipos de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificación de microorganismos entéricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes químicos e indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

  • Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas, como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
  • Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
  • Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
  • Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico.

Pruebas Bioquímicas son  la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:

  • Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.
    • Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad para la producción de H2S en cepas de E. coli.
  • Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba detecta la producción de  la enzima β-galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos que no la utilizan. La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa, el cual es  inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
    • E. coli es positiva para esta prueba
  • Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la cual produce la hidrólisis de la gelatina.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de glucosa.
    • 99% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.
    • esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
  • Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima fenilalanina desaminasa es útil para diferenciar inicialmente a las especies de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos gram negativos.
    • 0% de positividad para cepas de E. coli.
  • Producción de descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas especies bacterianas poseen enzimas que tienen la capacidad de descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos entre ellos la arginina, lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina y CO2.
    • 17% de positividad para Arginina.
    • 90% de positividad para Lisina.
    • 65% de positividad para Ornitina.
  • Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.
    • 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptofano.  Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.
    • 98% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.
    • 1% de positividad para cepas de E. coli.
  • Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas bacterias de utilizar el malonato como fuente de carbono y energía.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el nitrato a nitrito o gas. Es útil en la identificación de la familia Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos otros grupos de microorganismos.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo de base púrpura de bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una concentración del 1% para la determinación de la fermentación de carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
    • D-Sorbitol 94% de positividad.
    • Lactosa 95% de positividad.
    • Sacarosa 50% de positividad.
    • D-Manitol 98% de positividad.
    • D-Adonitol 5% de positividad.
    • L-Arabinosa 99% de positividad.
    • Maltosa 96% de positividad.

Fuente:

Rojas N, Chaves E, García F (2006) Bacteriología Diagnóstica, Costa Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología.

García R, Córdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria

Imágenes:

Cabronio 5.9, Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas, http://es.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas

Experiencias – Pruebas Bioquímicas para Bacteriología

Las pruebas bioquímicas nos muestran reacciones que son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. Para la identificación de las bacterias, el laboratorio de diagnóstico necesita conocer las características físicas y metabólicas de las mismas. Una vez conocidas las características físicas del microorganismo, se analizan sus reacciones metabólicas tales como la producción de enzimas, metabolitos intermedios, oxidación y fermentación entre otras.  A través de los años se han desarrollado pruebas aprovechando estos conocimientos y ya se tiene pruebas estandarizadas que se elaboran a partir de preparados comerciales que son medios de cultivo conteniendo el compuesto sobre el cual las enzimas bacterianas actúan complementado con indicadores que ponen de manifiesto la reacción que se llevó a cabo.

En el laboratorio se llevan a cabo diversos tipos de análisis bioquímicos:

  • Pruebas en Tubo de ensayo: En este caso  requieren patrones de inoculación específicos para los tubos con agar inclinado, con medio sólido horizontal o  con medio semisólidos. En el caso del tubo con agar inclinado, la inoculación se realiza a partir de una colonia aislada tomada de una placa petri. Con el asa se traslada el inoculo a la superficie del medio que se siembra por estrías, a veces es necesario practicar una incisión en la superficie del agar, la cual no debe llegar hasta el fondo.
    La inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con superficie horizontal, se realiza utilizando un alambre recto. El método de sembrado consiste en inocular por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio.
    Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (Medio SIM); se inocula utilizando un alambre recto tratando que la incisión no llegue al fondo del tubo.
    El laboratorio dentro del protocolo de aislamiento de Salmonellaspp. maneja tres pruebas bioquímicas para discriminar entre cepas:

    • Prueba de descarboxilación de la Lisina (LIA): Esta prueba mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido formando una amina, con la consiguiente alcalinidad. El LIA es un medio diferencial empleado para caracterizar las Enterobacterias. Es muy útil para diferenciar tempranamente cepas de Salmonella y Arizona de Citrobacter.
    •  Urea: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desdoblar, la Urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Esta prueba se utiliza para diferenciar los organismos del género Proteus rápidamente ureasas positivos de otros miembros de las Enterobacterias.
    • Prueba del medio Triple Sugar Iron (TSI): Esta prueba determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico en un medio de crecimiento básico, con la producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.

Las Técnicas de API, son un recurso rápido para el diagnóstico bacteriano, consiste en tiras que contiene microtubos para evaluar las reacciones específicas de las bacterias. Este método da un patrón de reacción que difiere entre especies y subespecies; este recurso es utilizado en etapas finales de la identificación bacteriana. El Laboratorio de Bacteriología de alimentos cuenta con:

  • API 20 E: EL sistema de API 20 E facilita en 24 horas la identificación de Enterobacterias. También puede identificar otras bacterias gram negativas en 24 a 48 horas. Esta prueba posee los substratos deshidratados para la demostración de la actividad enzimática y fermentación de carbohidratos. Los substratos se reconstituyen por la adición de una suspensión bacteriana. Después de la incubación los productos metabólicos se detectan por sistemas indicadores o por la adición de reactivos.
  • API Listeria: El API Listeria contiene 10 pruebas para obtener en 24 horas la identificación bioquímica de aislamientos de Listeria. Esta prueba abarca el 85% de las cepas de Listeria, también se puede diferenciar entre Listeria monocytogenes y L. innocua en base a la ausencia de arilamidas.

Fuente:

  • J Bille, B Catimel, E Bannerman, C Jacquet, M N Yersin, I Caniaux, D Monget, and J Rocourt, API Listeria, a new and promising one-day system to identify Listeria isolates, Centre National de Référence des Listeria, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Switzerland, Appl Environ Microbiol. 1992 June; 58(6): 1857–1860.
  • Raúl García Tinajero, Rodolfo Córdoba Ponce, Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria, México, 1998
  • Toronto Medical Laboratories/ Mount Sinai Hospital Microbiology Department Policy and Procedure Manual, Identificaction of Enterobacteriaceae (API 20E), Canadá, 2002.