Identificación Bioquímica de Salmonella spp.

Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium

La identificación de Salmonella spp., es de gran importancia en la industria alimentaria (desde la planta de producción hasta la planta de procesamiento), para reducir la probabilidad de contaminación en alimentos, especialmente cuya fuente sea avícola.

Para la identificación de una bacteria es requerida la aplicación de pruebas bioquímicas, especialmente las pruebas que involucran el metabolismo bacteriano, dónde las enzimas características de cada cepa revelen la identidad de la bacteria a describir.

La identificación bioquímica de una bacteria se conoce como batería bioquímica, dónde se emplea una serie de tubos con medios especiales en los que se va evaluar el metabolismo de la bacterias y las enzimas presentes y ausentes.

El primer paso comienza al lograr aislar las colonias sospechosas de ser de Salmonella spp., éstas deben ser transferidas con un asa bacteriológica en punta estéril a una serie de pruebas bacteriológicas, con los medios de TSI (Triple sugar iron) y LIA (Lysine-iron agar)

El medio TSI, contiene: peptona, agar, lactosa, sucrosa, cloruro de sodio, extracto de carne, extracto de levadura, glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol. Su uso principal es para la diferenciación de miembros de Enterobacteriaceae basado en la fermentación de la lactosa, sucrosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico.

Para la preparación de LIA, se requiere de: agar, L-lisina, digesto pancreático de gelatina, extracto de levadura, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio y púrpura de bromocresol, a un pH final entre 6.7 ± 0.2. Su aplicación es para el cultivo y diferenciación de los miembros de Enterobacteriaceae basado en su habilidad de descarboxilar lisina y formas ácido sulfhídrico. Las bacterias que descarboxilan lisina tornan el medio en púrpura y las bacterias que producen ácido sulfhídrico se muestran como colonias negras.

En cada prueba se debe deslizar el asa bacteriológica de forma estríada en la superficie del agar y luego introducir la punta del asa en los medios evaluados. Es importante señalar que el pase de las colonias debe realizarse a partir de una colonia bien aislada, dado que LIA y TSI, son empleadas para seleccionar bioquímicamente colonias sospechosas de Salmonella spp. Si se introduce un cultivo mixto en éstos medios, los resultados pueden ser inespecíficos.

Si las colonias sospechosas son encontradas solo es áreas cargadas de colonias mixtas  en el agar,  es prudente re-sembrar las colonias sospechosas, con el fin de obtener un cultivo puro previo a la inoculación de éstas colonias en TSI y LIA. Estos medio diferenciales deben ser evaluados después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Salmonella en TSI and LIA

Salmonella en TSI and LIA

Es particularmente importante con TSI, ya que una inclinación ácida a las 24 horas a menudo vuelve a ser alcalina con una incubación más prolongada, debido a los componentes proteicos del medio que usan después del agotamiento de los carbohidratos. Las observaciones con respecto al gas y al ácido sulfhídrico son útiles y se debe concentrar la atención en las reacciones al extremo y en la inclinación de los cultivos, independientemente si se manifiesta el ácido sulfhídrico o la producción de gas.

También debemos tener que en cuenta que las muestras de laboratorio que se envían pueden contener varios patógenos entéricos, no solo Salmonella y se pueden agregar agares selectivos/diferenciales para colectar más información para su identificación. Otros medios que se pueden utilizar además de LIA y TSI son:

  • Medio de Indol y Ornitina de motilidad (MIO)
  • Agar de Urea de Christensen
  • Citrato de Simmon
  • Motilidad de ornitina

En un aislado de Salmonella, se espera que en sus pruebas bioquímicas, esta descarboxile la lisina en LIA, fermente la glucosa anaeróbicamente en agar TSI, produzcan ácido sulfhídrico en agar TSI y en LIA. En las pruebas complementarias se espera que utilice el citrato, que tenga incapacidad para hidrolizar urea, producir indol a partir de triptófano.

Las reacciones de azúcar, comprenden la fermentación de glucosa manitol, maltosa y dulcitol y la incapacidad de fermentar lactosa, sacarosa y salicina. Estas reacciones bioquímicas se pueden llevar a cabo convenientemente en los medios compuestos para la identificación bacteriana, como el agar Kohn o  TSI.

Los cultivos que dan las reacciones bioquímicas características de las especies de Salmonella se prueban con los sueros O y H apropiados hasta que se identifican el grupo y el serotipo. Las pruebas bioquímicas para la identificación de salmonellas se pueden combinar para formar una prueba de identificación. Algunos de estos, como los sistemas API 20E o Enterotube II, están actualmente disponibles para su compra.

 

Fuente:

  1. Yousef, Ahmed Elmeleigy. (2003). Food microbiology : a laboratory manual. Hoboken, N.J. :John Wiley & Sons.
  2. Lister, S. A., & Barrow, P. (2008). Enterobacteriaceae. In Poultry Diseases (Sixth Edition) (pp. 110-145).
  3. García, M., & Silva, M. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Identificación bioquímica y tipado microbiológico. Unidad didáctica55, 346.
  4. Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2013). Handbook of media for clinical and public health microbiology. CRC Press.
  5. Atlas, R. M. (2006). The handbook of microbiological media for the examination of food. CRC Press.
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Experiencias – Pruebas Bioquímicas para Bacteriología

Las pruebas bioquímicas nos muestran reacciones que son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. Para la identificación de las bacterias, el laboratorio de diagnóstico necesita conocer las características físicas y metabólicas de las mismas. Una vez conocidas las características físicas del microorganismo, se analizan sus reacciones metabólicas tales como la producción de enzimas, metabolitos intermedios, oxidación y fermentación entre otras.  A través de los años se han desarrollado pruebas aprovechando estos conocimientos y ya se tiene pruebas estandarizadas que se elaboran a partir de preparados comerciales que son medios de cultivo conteniendo el compuesto sobre el cual las enzimas bacterianas actúan complementado con indicadores que ponen de manifiesto la reacción que se llevó a cabo.

En el laboratorio se llevan a cabo diversos tipos de análisis bioquímicos:

  • Pruebas en Tubo de ensayo: En este caso  requieren patrones de inoculación específicos para los tubos con agar inclinado, con medio sólido horizontal o  con medio semisólidos. En el caso del tubo con agar inclinado, la inoculación se realiza a partir de una colonia aislada tomada de una placa petri. Con el asa se traslada el inoculo a la superficie del medio que se siembra por estrías, a veces es necesario practicar una incisión en la superficie del agar, la cual no debe llegar hasta el fondo.
    La inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con superficie horizontal, se realiza utilizando un alambre recto. El método de sembrado consiste en inocular por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio.
    Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (Medio SIM); se inocula utilizando un alambre recto tratando que la incisión no llegue al fondo del tubo.
    El laboratorio dentro del protocolo de aislamiento de Salmonellaspp. maneja tres pruebas bioquímicas para discriminar entre cepas:

    • Prueba de descarboxilación de la Lisina (LIA): Esta prueba mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido formando una amina, con la consiguiente alcalinidad. El LIA es un medio diferencial empleado para caracterizar las Enterobacterias. Es muy útil para diferenciar tempranamente cepas de Salmonella y Arizona de Citrobacter.
    •  Urea: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desdoblar, la Urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Esta prueba se utiliza para diferenciar los organismos del género Proteus rápidamente ureasas positivos de otros miembros de las Enterobacterias.
    • Prueba del medio Triple Sugar Iron (TSI): Esta prueba determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico en un medio de crecimiento básico, con la producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.

Las Técnicas de API, son un recurso rápido para el diagnóstico bacteriano, consiste en tiras que contiene microtubos para evaluar las reacciones específicas de las bacterias. Este método da un patrón de reacción que difiere entre especies y subespecies; este recurso es utilizado en etapas finales de la identificación bacteriana. El Laboratorio de Bacteriología de alimentos cuenta con:

  • API 20 E: EL sistema de API 20 E facilita en 24 horas la identificación de Enterobacterias. También puede identificar otras bacterias gram negativas en 24 a 48 horas. Esta prueba posee los substratos deshidratados para la demostración de la actividad enzimática y fermentación de carbohidratos. Los substratos se reconstituyen por la adición de una suspensión bacteriana. Después de la incubación los productos metabólicos se detectan por sistemas indicadores o por la adición de reactivos.
  • API Listeria: El API Listeria contiene 10 pruebas para obtener en 24 horas la identificación bioquímica de aislamientos de Listeria. Esta prueba abarca el 85% de las cepas de Listeria, también se puede diferenciar entre Listeria monocytogenes y L. innocua en base a la ausencia de arilamidas.

Fuente:

  • J Bille, B Catimel, E Bannerman, C Jacquet, M N Yersin, I Caniaux, D Monget, and J Rocourt, API Listeria, a new and promising one-day system to identify Listeria isolates, Centre National de Référence des Listeria, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Switzerland, Appl Environ Microbiol. 1992 June; 58(6): 1857–1860.
  • Raúl García Tinajero, Rodolfo Córdoba Ponce, Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria, México, 1998
  • Toronto Medical Laboratories/ Mount Sinai Hospital Microbiology Department Policy and Procedure Manual, Identificaction of Enterobacteriaceae (API 20E), Canadá, 2002.